基于数字微流控技术的单细菌全基因组及耐药表型分析新技术

抗生素的广泛使用进一步促进了细菌耐药性（AMR），严重威胁人类健康。识别和了解AMR性对于治疗耐药性感染的临床实践和限制耐药性传播至关重要。抗生素敏感性试验（AST）是检测AMR的传统方法，包括传统的AST方法：微量肉汤稀释（BMD）和纸片扩散法，以及新兴的快速AST技术：基于微流控的AST、基于显微镜的AST和基于代谢标记的AST。然而，这些方法通常只提供表型耐药性结果，如抗生素敏感性或最低抑菌浓度（MIC），而没有阐明耐药性的分子机制。此外，病原表型敏感性测试在检测可重复性方面也面临一些挑战，且某些耐药基因的表达需要一段时间的抗生素诱导。相比之下，基于测序的AMR分析方法，如全基因组测序（WGS），可在基因组水平提供对AMR的全面见解：阐明了菌株潜在的耐药分子机制，并能够预测未经抗生素治疗的菌株的耐药/敏感表型。其中，单细菌细胞全基因组测序（sbWGS）能够进一步提供细菌异质性的详细蓝图，并以高分辨率准确地揭示抗生素耐药机制，越显优越性。此方法以最少的样本进行测序，不依赖于培养，特别适用于生长缓慢或难以培养的物种，如结核分枝杆菌和军团菌。尽管如此，当前对某些抗生素耐药机制的知识储备有限，仅仅依赖基于WGS的AMR检测可能也会产生一些不准确的结果。因此，在单个细菌水平上建立基因型和表型之间的准确相关性，对于确保基于WGS的抗生素耐药性分析的可靠性至关重要。基于此，厦门大学杨朝勇团队基于数字微流控（DMF），发展了一种单细菌全基因组及耐药表型分析新技术（Digital-GPA），致力于在单细菌细胞水平上实现试验菌株的基因型和表型分析。

本研究的实现涉及到3个关键点（图1）：（1）利用FDAA代谢标记实现耐药菌和敏感菌的界定：FDAA对细菌的荧光标记强度可以准确反应细菌的代谢活性。通过FDAA代谢标记，Digital-GPA可在3.5 h内快速地从表型上检测细菌的药敏性；（2）利用DMF实现样品中特定表型的单细菌的分离、裂解及核酸扩增（MDA），约10 h；（3）单细菌基因组测序，7-8 h。此研究基于DMF将FDAA代谢标记与单细菌基因组测序联用，开发了可以同时检测单细菌表型和基因型的Digital-GPA平台。该平台能够快速测定细菌的表型药敏并获得高质量、低污染的单细菌基因组，二者检测结果可以相互验证，使结果更准确。总体而言，本研究成功实现了在单细胞水平上对细菌进行快速、准确的药物敏感性检测，并提供了更为全面的药敏性信息，这为研究细菌耐药机制和临床感染的快速、精确诊断提供了一种新的手段。

图1 单个细菌基因型-表型抗生素耐药性分析的Digital-GPA工作流程示意图。（A）表型耐药性分析：FDAA标记用于快速鉴定耐药菌。细菌、高剂量抗生素、FDAA探针（Cy5ADA）一齐共孵育，完成耐药/敏感细菌的标记。（B）单细菌细胞全基因组测序工作流程：将标记后的细菌加载入DMF芯片，分离FDAA标记的耐药细菌，裂解扩增，进行文库制备和测序。

原文doi：10.1002/smll.202402177