30分钟出结果！克雷伯氏肺炎杆菌即时诊断新突破！

研究背景：克雷伯氏肺炎杆菌是一种广泛存在于医院环境中的致病菌，它能够引起包括肺炎在内的多种严重感染，尤其在免疫力低下的患者中更是致命的威胁。随着抗生素耐药性的不断增加，快速准确地诊断克雷伯氏肺炎杆菌感染变得尤为重要，这对于指导临床合理使用抗生素、控制感染的传播、减少医疗成本以及提高患者生存率都有显著影响。而传统的实验室检测方法耗时或需昂贵的仪器和熟练的操作员，限制了在临床即时快速检测方面的应用。基于 CRISPR的检测方法逐渐发展，具有高灵敏度、方便快捷的优点。近期，北京化工大学史硕博教授等构建了一种用于样品提取的快速室温前处理方法，并改进了基于 Cas12a 的技术，以开发一种免提取的一锅法病原体检测方法，并在Biosensors and Bioelectronics上进行发表。

EXORCA检测流程：

该检测试剂盒只需两个步骤即可检测临床样品：快速预处理（约1 min）和 RPA/Cas12a 检测（约30 min）。预处理主要是将裂解液与样本呢混匀。随后，混合物直接进行 RPA/Cas12a 检测。使用次优 PAM 的 crRNA 由于 Cas12a 的活性降低而具有较慢的 CRISPR 检测动力学，从而使反应偏向等温扩增。随后，RPA 产生足够的扩增子，可以被 Cas12a/crRNA 二元复合物识别，这反过来促进 Cas12a 的反式切割反应。这种活性导致 ssDNA 荧光探针的切割，从猝灭剂中分离荧光团，从而发射荧光信号。

检测效果：

如下图所示，通过荧光读数器获取结果的方法的检测范围在10^-1-10^-7CFU/μL，而通过肉眼直接在蓝光下观察获取检测结果的方法的检出限大概在10^-1CFU/μL 。而且该检测方法具有良好的特异性，对于不同的克雷伯氏肺炎杆菌均能达到较好的响应，而对于非克雷伯氏肺炎杆菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎链球菌等常见的致病菌），均呈现阴性结果。并且研究人员设计了这几种菌的 crRNA 序列使用EXORCA的方法进行检测，均得到了较好的检测结果。这些结果说明了该方法具有良好的灵敏度、特异性、便捷性等优点，对于临床即时检测提供了新方法和新思路。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116740