基于分子印迹聚合物的电化学传感器用于快速检测遮蔽脱氧雪腐镰刀菌素

引言

脱氧雪腐镰刀菌素(deoxynivalenol, DON)是一种由福萨里姆属真菌自然产生的有毒霉菌毒素,广泛存在于植物性产品中,无论是在田间还是在储藏过程中。DON高度稳定,耐磨、耐加工和耐加热,会导致人畜临床中毒,引起腹痛、腹泻和呕吐等症状。在植物受到DON污染后,在尿苷二磷酸葡萄糖转移酶(UGTs)的作用下,可以形成一种更加亲水的遮蔽型霉菌毒素脱氧雪腐镰刀菌素-3-葡萄糖苷(D3G)。D3G常常与DON同时污染谷物及其相关产品。例如在从阿根廷采集的粉质小麦中,DON的最高浓度达到9480 μg/kg,94%的样品中检出D3G,浓度高达850 μg/kg。在美国,D3G/DON被视为小麦抗吉布勒拉毒素能力的一个关键评价指标。虽然有关D3G毒性的数据仍然较少,但D3G主要在肠道菌群作用下转化为DON,可能会增加DON的生物利用度,对人畜健康造成潜在风险。联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家委员会(JECFA)将D3G视为饮食DON暴露的额外贡献因素[8],欧洲食品安全局(EFSA)认为D3G的毒性与DON相似,并将DON、3-乙酰化-DON、15-乙酰化-DON和D3G的容许每日摄入量设定为1 μg/kg体重/天。

D3G的广泛存在和潜在毒性,促进了人们对这种遮蔽型霉菌毒素快速、灵敏和准确检测方法的研究。迄今为止,只有高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)或HPLC才能成功分析D3G。尽管这些方法准确和灵敏,但大型检测仪器也存在检测时间长、成本高、实验步骤繁琐等缺点。近年来,电化学技术由于其简单、低成本、高灵敏度、便携性和微型化等优点而广受关注,并已被用于农药、药物和霉菌毒素的分析。

为了建立一种可靠的电化学生物传感器用于D3G检测,需要解决的关键问题是制造一种高效识别元件。目前尚未发现针对D3G的人工核酸适体或抗体。为了克服这一障碍,分子印迹聚合物(MIP)通过模拟抗体-抗原相互作用并特异性结合目标分子的特点,被提出作为一种替代方法。在模板分子的存在下,MIP可通过共聚合功能单体和交联剂来合成,去除模板后形成特异性识别位点,具有良好的稳定性、高选择性和灵敏度等优势。

由于样品中D3G浓度通常很低,为了提高电化学生物传感器的灵敏度,必须对可检测信号进行放大。酶催化、核酸和分子转化放大等各种信号放大策略已被开发。在这些方法中,利用能够在温和条件下专一性、选择性地催化各种反应的酶进行放大引起了广泛关注。然而,酶自身存在物理化学稳定性低、制备成本高等固有局限性,促进了仿生酶的发展。纳米技术的进展表明,某些纳米材料,特别是金属基纳米颗粒,如CeO₂、Fe₃O₄、MnO₂和V₂O₅,具有模拟天然酶催化活性的能力。这些纳米酶具有成本低、表面修饰简单、活性优异、稳定性高等独特优点,在电化学检测中非常适用。

本研究开发了一种基于MIP的电化学传感器,用于敏感、选择性和快速检测D3G。以表面功能单体导向策略电化学聚合MIP,提高了D3G分子的吸附能力,有效区分其与结构相似的其他霉菌毒素(如DON)。利用含有Ce³⁺和Ce⁴⁺氧化态的CeO₂模拟过氧化酶活性,Mn掺杂生成更多氧空位大大提高了其催化活性。所合成的Mn-CeO₂不仅作为具有优异催化活性的纳米酶用于信号放大,还作为具有大比表面积、优良导电性和良好生物相容性的底材承载识别元件。这为开发用于快速检测D3G的简易电化学传感平台提供了创新策略,并可拓展至其他遮蔽型霉菌毒素检测。

结果与讨论

1. 纳米材料表征结果

首先通过SEM和TEM对合成的CeO₂和Mn-CeO₂纳米材料进行形貌表征。结果表明,纯CeO₂由平均直径约100 nm的分散均匀的纳米球组成,每个纳米颗粒表面较粗糙。经Mn掺杂后,制备的Mn-CeO₂保持了球形形貌和均匀分散。TEM进一步证实,Mn-CeO₂由众多细小纳米颗粒组装而成,透明区域可视为颗粒间的孔隙。这种层级结构赋予材料较大的比表面积和丰富的活性位点。通过电聚合o-苯二胺进一步与MIP结合后,Mn-CeO₂表面覆盖了一层可见的透明膜,在去除模板分子后不再可见,证实了通过-NH-键成功合成了聚(o-苯二胺)膜。元素映射表明,Mn、Ce和O在合成的Mn-CeO₂纳米酶中均匀分布。

UV-vis吸收光谱表明,o-苯二胺与D3G之间存在分子间氢键相互作用,有利于在印迹聚合发生时D3G模板高效富集在Mn-CeO₂纳米颗粒表面,形成高密度的印迹位点。XRD数据显示,掺杂Mn后,CeO₂的立方荧石晶型结构保持不变,但衍射峰强度降低、峰宽增加,与Mn²⁺掺杂引起的晶格失配一致。拉曼光谱进一步证实,Mn掺杂导致CeO₂晶格出现缺陷。通过XPS分析发现,Mn-CeO₂中存在大量的Mn²⁺离子以及更多的表面氧空位和Ce³⁺含量,这些结构缺陷有利于提高Mn-CeO₂纳米酶的催化活性,如EPR结果所示。

2. MIP基电化学传感器的电化学性能

通过CV和EIS表征了MIP/Mn-CeO2/GCE电极的电化学行为。结果表明,Mn-CeO₂的引入显著提高了电极的导电性和电子传输能力,而MIP层的引入则阻碍了电子转移过程,去除D3G模板后略有改善。这些结果表明,所构建的MIP/Mn-CeO₂/GCE电极具有良好的电化学性能。

在优化条件下,SWV用于D3G的检测。结果显示,H₂O₂的还原峰电流在MIP/Mn-CeO₂/GCE上明显高于NIP/Mn-CeO₂/GCE,这归因于MIP层能够专一性地结合D3G,从而放大由Mn-CeO₂纳米酶催化的H₂O₂还原信号。随着D3G浓度的增加,H₂O₂还原峰电流显著降低,而在NIP/Mn-CeO₂/GCE上变化很小,充分证明了MIP在提高D3G检测选择性和灵敏度方面的作用。在最佳条件下,D3G检测的线性范围为0.01-50 ng/mL,检出限可达0.003 ng/mL,并成功应用于谷物样品中D3G的检测,表明其实用性。

结论

综上所述,作者成功构建了一种基于MIP的电化学传感器,用于敏感、选择性和快速检测D3G这种重要的遮蔽型霉菌毒素。以表面功能单体导向策略电化学聚合MIP,提高了D3G分子的吸附能力,并利用Mn-CeO₂纳米酶作为信号放大剂和优异的电极材料,大幅提高了检测性能。该传感器不仅具有良好的线性范围、低检出限和高重现性,而且可成功应用于实际谷物样品检测,为快速、灵敏和选择性检测D3G提供了创新解决方案,并为其他遮蔽型霉菌毒素检测铺平道路。

参考文献

Nie, D.; Zhu, X.; Liu, M.; Cheng, M.; Fan, K.; Zhao, Z.; Huang, Q.; Zhang, X.; Han, Z., Molecularly imprinted polymer-based electrochemical sensor for rapid detection of masked deoxynivalenol with Mn-doped CeO₂ nanozyme as signal amplifier. J. Hazard. Mater. 2024, 477, 135366.