即用型比率生物发光传感器用于检赭曲霉毒素A

霉菌污染是世界范围内一个严重的问题，不仅对人类和动物健康造成不利影响，而且对全球经济和国际贸易造成破坏。赭曲霉毒素是某些曲霉属和青霉属真菌产生的一种典型的真菌此生代谢产物，其中赭曲霉毒素A（OTA）毒性最高，在食品中分布最广，在不破坏食品的情况下无法消除。由于其高毒性和频繁存在，许多国家和组织都制定了严格的食品中赭曲霉毒素A的最高限量标准。因此，通过有效的筛选方法检测和定量食品及原料中的OTA含量，对确保食品安全具有重要意义。目前OTA的检测方法分为常规和快速方法。最快速的OTA检测方法是基于免疫检测形式，其灵敏度高且易于操作。

NanoLuc萤光素酶是一种新型的萤光素酶，其由两个亚基组成，‌分别是“Large BiT”（Lg，18 kDa）和“Small BiT”（Sm，1.3 kDa）。‌它具有分子量更小，发光更亮，比任何现有的生物发光酶用途更加广泛的特点，是目前性能最好的生物发光报告基因之一。

得益于荧光素酶的独特性质，海南大学刘星等将特异性结合OTA纳米抗体Nb28的模拟表位肽与C4bpa（一种自组装七聚结构域）和Sm融合，构建多价Sm标记的模拟表位肽MPSm，作为竞争抗原（即Sm标记的OTA-BSA共轭物）。同时，引入绿色增强纳米灯（绿色发光融合蛋白，GeNL）作为荧光素酶的校准器，具有绿光发射，提供稳健的蓝/绿比率读数和直接内部校准，绿色荧光蛋白mNeonGreen与荧光素酶的N端融合。在比率发光生物传感方案中，基因融合蛋白NLg和MPSm都是具有双重功能的生物分子，分别作为具有信号标记的抗体和抗原，重构后的两个信号标签可以提供蓝光发射。即NLg和MPsm的结合触发了荧光素酶的重构，从而催化了荧光素酶底物，并在458 nm处产生蓝色发射峰。同时，GeNL可以通过生物发光共振能量转移从底物产生518 nm的绿色信号。在OTA存在的情况下，MPSm与OTA竞争结合NLg，破坏了重构荧光素酶的生成，导致蓝光发射减少，蓝绿比较低。生物发光信号和颜色信息的变化值，包括红（R）、绿（G）、蓝（B）可以被微孔板阅读器和智能手机记录和捕获。因此，OTA的浓度可以与比率生物发光信号的变化联系起来，通过智能手机测量蓝绿比的变化。

图1  用于OTA检测的均匀生物发光免疫传感器检测原理。

研究要点及结果：

（1）NLg，MPSm以及GeNL的表达和纯化。

（2）验证构建的OTA的比率发光免疫生物传感器的可行性。该免疫传感器由三部分组成，包括分裂的NanoLuc荧光素酶的大片段标记的纳米抗体、分裂的NanoLuc荧光素酶的小片段标记的纳米肽七聚体（竞争抗原）和荧光素酶的校准物。

（3）免疫传感器条件优化。

（4）免疫传感器的分析性能评估。结果表明，构建的比率型生物发光传感器的微孔板检出限为0.98 ng/mL，智能手机检出限为1.89 ng/mL。交叉反应分析和回收率实验证明该免疫传感器具有良好的选择性和准确性。

（5）实际样品检测中的应用。采用构建的免疫传感器测定了10份商品辣椒粉样品中的OTA含量，并用高效液相色谱法进行了验证，结果表明两种方法的检测结果具有良好的相关性，说明两种方法具有较好的可靠性。

创新性：

（1）比率荧光生物传感器，内置自校准，提高检测准确性；

（2）传感器所需主要元件可通过基因克隆表达获得，成本易于控制。

研究结论：

本研究建立了一种比率荧光生物传感器，用于简单、快速、即用型的检测辣椒中的OTA。所制备的免疫传感器操作简单、快速。该免疫传感器只需将传感器组件和样品混合在仪器进行10分钟的孵育，无需额外的洗涤和孵育步骤，即可实现OTA的均匀检测。其次，免疫传感器的三个组分（NLg，MPSm和GeNL）易于在微生物表达系统中克隆，成本低，易于进一步亲和纯化。制备的传感器组件可以直接使用，无需额外修改，这使得构建的免疫传感器成为即用型分析工具。此外，该免疫传感器结合了高通量和便携性的优势，测试在96孔板中进行大规模筛选，结果可以使用智能手机或带有便携式电源的小型化微孔板读取器进行量化。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116401