肿瘤标志物在癌症早期诊断、治疗监测和预后评估中扮演着至关重要的角色。传统的肿瘤标志物检测方法，例如酶联免疫吸附测定（ELISA），存在灵敏度低、操作繁琐、检测周期长等局限性，难以满足临床对肿瘤早期诊断的需求。近年来，各种新型纳米材料，例如量子点、碳纳米管和金属纳米颗粒，凭借其独特的物理化学性质，为开发高灵敏度、高特异性的肿瘤标志物检测技术提供了前所未有的机遇。这些纳米材料可以作为信号放大器、靶向识别元件或药物载体，显著提高肿瘤标志物的检测灵敏度、特异性和生物利用度。例如，荧光量子点具有优异的光学性质，包括宽吸收光谱、窄发射光谱、高荧光量子产率和良好的光稳定性，被广泛应用于构建高灵敏度的荧光探针，用于肿瘤标志物的成像和检测。此外，磁性纳米材料，例如Fe₃O₄纳米颗粒，可以与肿瘤标志物特异性结合，并在外加磁场的作用下实现对肿瘤细胞或组织的特异性分离和富集，提高检测的灵敏度和特异性。值得一提的是，将多种功能纳米材料整合到一个平台上，构建多功能纳米探针，可以实现对肿瘤标志物的多模式成像和联合治疗，为肿瘤的精准诊疗提供新的策略和方法。

基于此，中国石油大学的研究者提出了一种基于CRISPR-Cas13a和氧化石墨烯（GO）的新型microRNA（miRNA）检测平台。如图1b所示，首先利用抗体功能化的MagAushellNPs从样品中捕获目标N蛋白，通过磁分离进行纯化和富集。随后，将MagAushell-Ab2和MagAushell-Ab1-N蛋白复合物加载到试纸上，试纸将向吸收垫方向移动，并被t线上的N蛋白抗体捕获，形成棕色条纹。同时，含有鸡IgY抗体的MagAushell-Ab2继续流向c线区域，被c线上的山羊抗鸡IgY抗体捕获，形成第二棕色条纹。对于不含N蛋白的阴性样品，MagAushell-Ab1不能与t线反应，只有MagAushell-Ab2被c线捕获。因此，c线上只会出现一条棕色的条纹。对于c线没有出现任何颜色的情况，测试条是无效的。因此，分别通过目视观察彩色条纹并分析其光热信号，实现了定性和定量（双模）检测。方案1c给出了阳性和阴性样品的典型检验结果。在检测中，使用MagAushell-Ab1和MagAushell-Ab2两种探针。与N蛋白抗体（HDS-A5089）偶联的MagAushell-Ab1能特异性识别目标N蛋白，并通过t线捕获。含有鸡IgY抗体的MagAushell-Ab2在c线上与山羊抗鸡IgY抗体反应作为对照。

图1.MagAushellNPs探针的制备及其在LIFA生物传感器中的应用（a）MagAushellNPs的合成和功能化流程图。（b）LFIA的结构和检测原理示意图。（c）解释测试结果以及视觉和红外热像仪观察的典型阳性和阴性结果。

研究人员首先以直径35 nm的银纳米粒子为模板，通过纳米级电交换法制备了金纳米壳。他们发现，随着氯金酸用量的增加，金纳米壳的表面等离子体共振（SPR）峰逐渐红移。然而，过量的氯金酸会导致金纳米壳结构破坏，影响其稳定性。因此，他们选择了最佳的银/金摩尔比，制备出SPR峰位于760 nm且结构完整的金纳米壳。此外，他们还利用溶剂热法合成了Fe₃O₄纳米团簇。透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）和粒度分析结果表明，合成的Fe₃O₄纳米团簇具有良好的分散性、球形形貌以及约310 nm的平均粒径。磁性测试结果证实，Fe₃O₄纳米团簇具有良好的超顺磁性能。

图2.（A）AuNPs和DNA条形码功能化的AuNPs的代表性紫外-可见吸收光谱；（B）动态光散射测定AuNPs和GPD-3CL探针的尺寸；（C）不同浓度3CL蛋白酶处理GPD-3CL探针的时间依赖性荧光曲线；（D）GPD-3CL探针在CRISPR实验

研究人员利用聚乙烯亚胺介导的静电作用，将Fe₃O₄纳米团簇成功包覆在金纳米壳表面，制备出MagAushell纳米颗粒。透射电子显微镜图像显示MagAushellNPs分散性良好，且其表面分布着大量中空多边形纳米颗粒。能量色散X射线光谱分析进一步证实了MagAushellNPs的成功合成，Fe和O元素分布于整个纳米颗粒中，而Au元素则呈现出空心结构。MagAushellNPs保留了Fe₃O₄纳米团簇的超顺磁性，同时展现出良好的光热转换效率和稳定性。此外，通过zeta电位分析和试纸条测试，研究人员证实了抗体可以成功偶联到MagAushellNPs上，且抗体保持了良好的生物活性。

图3.MagAushellNPs的表征。（a-b）MagAushellNPs的TEM图像。（c-f）Fe、O、Au的EDX元素映射及覆盖层。（g）Fe₃O₄纳米团簇和MagAushell纳米粒子的磁滞回线。（h）激光辐照（808 nm，1.44 W/cm2，10 min）下Au纳米壳、Fe₃O₄纳米团簇和MagAushell纳米粒子的加热和冷却曲线。（i）激光辐照（808 nm，1.1 W/cm2）下MagAushellNPs溶液在光热加热和冷却循环下的稳定性研究。（j）Fe₃O₄纳米团簇、Fe₃O₄纳米团簇-pei、Au纳米壳、MagAushell和MagAushell-abNPs的Zeta电位。（k）装载MagAushell和MagAushell-abNPs的试纸照片。

为了优化该侧向免疫层析分析（LFIA）的性能，研究人员对多个实验条件进行了系统优化，包括辐照时间、辐照功率密度、试剂浓度以及孵育时间等。在最佳条件下，他们评估了该LFIA对SARS-CoV-2核衣壳蛋白（N蛋白）的检测灵敏度和线性范围。结果显示，通过肉眼观察，该LFIA的检测限为1 ng/mL，而经过磁富集步骤后，灵敏度提高了100倍。此外，通过分析光热信号，该LFIA的检测限可低至43.64 pg/mL，远低于传统胶体金试纸条。相比之下，自制的胶体金试纸条的检测限仅为40 ng/mL。这些结果表明，该基于MagAushellNPs的双模式LFIA具有更高的灵敏度，在病毒早期检测方面具有巨大潜力。

图4.（a）磁富集检测不同浓度N蛋白的试纸图像。（b）检测不同浓度N蛋白而不进行磁富集的试纸图像。（c）光热信号与N蛋白浓度的校正图及对应的光热图像。黑色星代表肉眼探测极限。

研究人员进一步评估了该双模式LFIA的特异性和重复性。为了验证特异性，他们选择了三种常见的人类流感病毒（维多利亚、山形和H1N1）作为对照。结果显示，只有在N蛋白样品中，测试条的t线出现明显的颜色，而其他三种流感病毒的测试结果与空白样品相同，仅在c线出现颜色。光热分析结果也显示，只有N蛋白组产生了显著的光热信号。这些结果表明该LFIA具有良好的特异性。此外，通过计算测定内和测定间的变异系数（CV），研究人员发现该LFIA的重复性良好，测定内CV为5.16%，测定间CV为7.66%。

图5.（a）sars-cov-2n蛋白检测试纸、维多利亚、山形、H1N1和空白样品的比色图。（b）特异性实验得到的光热信号直方图和对应的光热图像。

为了进一步验证该方法在复杂样品和实际样品中的可行性，研究人员首先进行了模拟真实样品的回收实验。他们在人工唾液中加入N蛋白，并利用该方法进行检测。结果显示，所有阳性样品均在测试条上呈现出两条清晰的棕色条纹。唾液样品的颜色强度与PBS样品相近，光热信号也与PBS样品接近。回收率在93%~115%之间，表明该方法在模拟唾液环境下仍具有良好的准确度和可靠性。随后，研究人员应用该方法对18个实际样本进行了检测，结果与商用胶体金试纸条的结果一致，进一步证实了该方法在实际应用中的潜力和可靠性，表明其在SARS-CoV-2N蛋白检测方面具有广阔的应用前景。

图6.PBS和唾液中SARS-COV-2N蛋白检测试纸的比色图（a）及其光热数据统计图（b）。

本研究成功构建了一种基于MagAushell纳米颗粒的双模式LFIA平台，用于高灵敏度检测SARS-CoV-2N蛋白。该平台利用PEI介导的自组装方法，将高光热转换效率的金纳米壳组装到Fe₃O₄纳米团簇表面，实现了磁性分离富集和光热信号放大。该平台的检测限低至43.64 pg/mL，远低于传统胶体金试纸条，甚至可与电化学传感器和微流控平台相媲美。此外，该平台还能有效检测临床样品中的低浓度病毒。因此，该平台有望成为一种经济高效的SARS-CoV-2大规模检测方法，并可推广至其他生物分子的临床检测。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115688