食源性病原体是导致食源性疾病暴发的主要因素，每年全球约有6亿人因食用受污染的食物而生病，42万人因此死亡。大肠杆菌是引发出血性肠炎和溶血性尿毒症的主要致病菌，通常与牛肉、猪肉、牛奶和蔬菜等食品相关。金黄色葡萄球菌则是导致大多数速发性食物中毒的主要原因，感染后可能引发心内膜炎、败血症等严重疾病。铜绿假单胞菌被认为是引起肠道和尿路感染的主要致病菌之一，具有较高的死亡率。现有的病原菌检测方法多存在预处理复杂和测量时间长等缺点，传统的培养和平板计数法虽然可靠，但需耗时36-72小时。酶联免疫吸附试验（ELISA）虽然灵敏，但操作复杂且耗时。聚合酶链反应（PCR）是准确的检测技术，但样品预处理繁琐，限制了其应用。因此，亟需开发高灵敏度、简单且低成本的实时现场检测技术。近年来，核壳分子印迹技术和聚集诱导发射（AIE）发光原材料在生物传感和生物成像领域得到了广泛应用。适体探针因其特异性强，常用于检测生物分子。结合适体探针与分子印迹材料的电化学双信号响应技术，铜绿假单胞菌的检测限可达到每毫升10个克隆形成单位（CFU/mL）。然而，适体探针通常依赖光学和电化学仪器，亟需寻找更简单、经济的替代方法。

基于此，广西大学的研究者提出了一种基于磁分离、荧光探针和智能手机图像处理的荧光传感器，用于灵敏检测多种致病菌。

如图1A所示，将肽作为蛋白酶底物，在其C端标记半胱氨酸，N端标记叠氮赖氨酸，随后通过无铜点击化学方法与一个24核苷酸长的二苯并环辛烷（DBCO）修饰的寡核苷酸（DNA）进行化学结合得到DNA条形码肽。该DNA序列被设计为与Cas12a复合物中的gRNA互补（去形成核糖核蛋白复合物，RNP）。将得到的DNA条形码肽功能化到柠檬酸盐包被的金纳米颗粒上，形成金-肽-DNA（GPD）混合探针。蛋白酶在GPDs上切割相应的底物并将DNA条形码释放到溶液中。通过离心去除AuNPs，使用CRISPR/Cas12a检测溶液中的DNA条形码。简单地说，DNA条形码与gRNA结合并激活Cas12a。激活的Cas12a切割多个荧光团（F）-淬灭剂（Q）标记的单链DNA序列，并产生荧光信号（图1B）。

图1传感器装置的制备说明。(A)三种磁性分子印迹材料的合成。(B)荧光探针的合成。(C)病原菌多重检测示意图。

关于传感器的设计如下：首先，使用AutoCAD绘制微流控芯片模具的三维模型，并通过3DStudioMax导出为STL文件。然后，选择透明光敏树脂作为3D打印材料，在1 cm厚的衬底上制作1 mm的微通道结构。集成传感器结构包括USB接口透镜、365 nmUV灯和智能手机图像处理应用。为了确保三种MIP类型均匀分布，底部添加了磁铁以固定MIP。

实验通过荧光显微镜研究了分子印迹聚合物（MIPs）在目标细菌上的吸附能力和动力学。研究中采用三种不同的印迹方法，分别使用盐酸多巴胺（DA）作为金黄色葡萄球菌的功能单体，丙烯酰胺（AM）和甲基丙烯酸（MAA）作为大肠杆菌的功能单体，以及AM和N，N'-亚甲基二丙烯酰胺（MBA）作为铜绿假单胞菌的功能单体。结果显示，三种MIPs的荧光强度较高，且随着细菌浓度的增加，MIP的荧光强度逐渐增强，表明其吸附能力良好。在10²至10⁸ CFU/mL的浓度范围内，未观察到表面饱和现象，说明聚合物的结合能力足以满足实验要求。选择10⁸CFU/mL作为后续实验的吸附浓度。随着孵育时间的增加，MIPs的荧光强度在0至40分钟内不断上升，随后趋于平稳，S-MIP和E-MIP的结合时间为40分钟，而P-MIP为30分钟，均足以完成分离过程。相比之下，非印迹聚合物（NIP）的吸附量与时间无关。实验结果进一步表明，MIP的吸附能力显著高于NIP，且与细菌浓度呈正相关，证明了MIP在细菌检测中的特异性和有效性。

图2三维模型设计图及传感器结构。(A)三维模型二维平面设计，(B、C、D)三维模型俯视图、俯视图和横断面三维设计图像，(E、F)三维物理模型俯视图和俯视图，(G、H)传感器装置组装。

本研究利用透射电子显微镜（TEM）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和X射线衍射（XRD）对Fe₃O₄、Fe₃O₄@SiO₂、S-MIP、P-MIP、E-MIP及其官能团的粒径和形貌进行了分析。结果显示，Fe₃O₄颗粒呈球形且尺寸均匀。SiO₂修饰后，Fe₃O₄@SiO₂形成典型的核壳结构，SiO₂壳层完全覆盖Fe₃O₄颗粒，且表面光滑。P-MIP和E-MIP的尺寸与Fe₃O₄@SiO₂相似，但二氧化硅层稍大，S-MIP则显示出明显的多巴胺层。通过电子显微镜观察，发现杆状大肠杆菌、杆状铜绿假单胞菌和圆形金黄色葡萄球菌分别聚集在E-MIPs、P-MIPs和S-MIPs上，验证了MIP对细菌的特异性吸附。FT-IR分析显示，580cm−1处的吸收波段为Fe₃O₄的Fe-O特征，S-MIP在1612cm−1和1502cm−1的特征波段表明多巴胺成功修饰了Fe₃O₄表面。SiO₂的特征吸收带在1092cm−1、800cm−1和462cm−1处，-OH的吸收带为3418cm−1，表明SiO₂成功加载到Fe₃O₄表面。XRD结果显示，Fe₃O₄的特征衍射峰在多个角度处出现，表明其晶型保持不变，但峰值强度减弱，说明表面被不同聚合物修饰。

图3MIP材料的表征。(A)Fe₃O₄，(B)E-mip，(C)P-MIP，(D)S-MIP，(E)Fe₃O₄@SiO₂，(F和I)E-mip添加大肠杆菌，(G和H)P-MIP添加铜绿假单胞菌，(H和K)S-MIP添加金黄色葡萄球菌。(L)Fe₃O₄，S-MIP，Fe₃O₄@SiO₂，E-MIP，P-MIP的FT-IR光谱。(M)Fe₃O₄，S-MIP，Fe₃O₄@SiO₂，E-MIP，P-MIP的XRD谱图。

本实验旨在利用时间密度泛函理论（TD-DFT）研究三种四苯乙烯（TPE）衍生物的不同荧光特性。通过对TPE分子进行修饰，获得具有不同荧光性质的衍生物。

研究表明，当多个TPE衍生物具有相同的给电子基团时，可以通过引入不同的电子吸收基团来调节其荧光发射光谱。利用GaussView软件进行初步理论计算，并通过高效液相色谱（HPLC）验证反应后的酰胺反应溶液中TPE衍生物与适配体形成的新物质，从而确认了荧光探针的合成。比较TPE、TPE-COOH、TPE-B-COOH和TPE-X-COOH的TD-DFT计算结果发现，TPE到TPE-X-COOH的LUMO-HOMO能隙（ΔEL-H）从4.1181 eV减小至3.0939 eV，表明最大激发波长发生红移，荧光特性因此不同。液相色谱分析显示，三种荧光探针的峰出现时间各异，分别为TPE-apt（13.8-20.0 min）、TPE-B-apt（20.5-26.8 min）和TPE-X-apt（20.5-27.0 min），通过不同保留时间进行HPLC纯化，高分辨率质谱进一步证实了产物的存在。

在没有目标细菌存在的情况下，TPE寡核苷酸荧光探针的荧光强度较弱。当细菌加入后，适体能够识别并结合细菌，导致TPE衍生物分子在细菌表面聚集；由于TPE分子的聚集诱导发光(AIE)性质，使得荧光强度显著增强。因此，荧光强度随着细菌浓度的升高而增加。

研究通过线性回归分析，建立了荧光强度(F)与目标细菌浓度(C)的对数之间的线性关系模型，细菌浓度范围为0-108CFU/mL。TPE-apt、TPE-B-apt和TPE-X-apt的线性回归方程分别为：荧光强度在40分钟时达到最大值，之后逐渐减弱并趋于稳定，这可能是由于细菌在培养过程中部分死亡，导致荧光探针无法识别而使荧光强度降低。通过Zeta电位和圆二色性分析，发现活菌对适体的识别能力和构象影响大于死菌。活菌表面的荧光强度也明显高于死菌。

图4荧光探针的理论设计、纯化及对细菌的荧光反应。(A)TPE-apt的HPLC纯化，(B)TPE-B-apt的HPLC纯化，(C)TPE-X-apt的HPLC纯化。(D)TPE衍生物和生物探针的荧光光谱。(E)dft计算的TPE导数HOMO和LUMO值(高斯09/B3LYP/6-31G(d))。(F)金黄色葡萄球菌，(I)大肠杆菌和(L)铜绿假单胞菌存在时荧光探针的荧光光谱。(G)金黄色葡萄球菌(S.aureus)、(J)大肠杆菌(E.coli)和(M)铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的荧光强度与浓度的标准曲线。荧光强度与细菌孵育时间(H)金黄色葡萄球菌、(K)大肠杆菌、(N)铜绿假单胞菌的关系。

研究人员探索了细菌的最佳吸附时间、浓度以及荧光探针对细菌进行定量检测。结果显示，当菌液浓度为1.0×10⁵ CFU/mL时，MIP吸附的荧光强度较高，之后逐渐下降。在最佳吸附时间(金黄色葡萄球菌：40 min，大肠杆菌：40 min，铜绿假单胞菌：30 min)下，MIP表面吸附的荧光强度达到最大值。此后，由于细菌死亡导致与MIP碰撞概率降低，荧光强度下降并趋于平衡。

利用构建的荧光传感器平台和智能手机图像处理，研究人员对三种目标菌进行了半定量分析。细菌溶液浓度范围为10³~10⁸ CFU/mL，数据拟合得到对数回归模型。结果表明菌液浓度与RGB值存在相关性，RGB分析可用于样品中特定细菌的定量。进一步检测混合菌时，单菌拟合曲线与混合菌的拟合结果高度吻合，可用于后续实验。通过分析每个孔的颜色分布及其对应的RGB值，可判断混合物中是否存在特定细菌并实现定量。

图5细菌的定量和定性分析及传感器的选择性。用荧光探针孵育细菌后，测定MIP表面的荧光强度，(A和D)金黄色葡萄球菌，(B和E)大肠杆菌，(C和F)铜绿假单胞菌。MIP表面RGB值与细菌浓度拟合曲线，(G)金黄色葡萄球菌，(H)大肠杆菌，(I)铜绿假单胞菌。(J)病原菌交叉验证检测。分子印迹材料与荧光探针的选择性。(K)3种印迹材料(1：大肠杆菌，2：铜绿假单胞菌，3：金黄色葡萄球菌，4：甲醇芽孢杆菌，5：枯草芽孢杆菌，6：蜡样芽孢杆菌)的特异性；(L)：三种荧光探针(1：金黄色葡萄球菌，2：大肠杆菌，3：铜绿假单胞菌，4：枯草芽孢杆菌，5：蜡样芽孢杆菌，6：甲醇芽孢杆菌，7：Tris-HCl溶液)的特异性。

研究人员通过比较分子印迹材料(MIPs)和荧光探针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌以及枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和甲醇芽孢杆菌的吸附能力，确认了MIPs和荧光探针的特异性。结果显示，三种MIPs在目标细菌表面的荧光强度明显高于其他细菌，而非印迹聚合物(NIPs)的荧光强度较弱。此外，荧光探针在目标菌液中的荧光强度非常高，而在其他细菌的菌液和缓冲液中则较低，证实了MIPs和荧光探针对细菌具有特异性吸附和检测能力。为进一步验证协同检测的可靠性，研究人员采用荧光探针对不同浓度的目标菌进行孵育，并用共聚焦显微镜拍摄荧光图像。结果与前期实验一致，随着目标菌浓度的增加，MIP吸附的荧光先升高后略有下降。

研究还阐述了协同检测的原理：将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的混合物与三种荧光探针孵育，由于MIP的特异性和富集功能，不同细菌会聚集在具有不同荧光的材料表面。TPE衍生物的AIE特性进一步增强了荧光强度，使得不同细菌可用肉眼区分。每种颜色都有特定的RGB值，因此可根据细菌浓度与RGB值的拟合曲线计算细菌浓度。为优化基于传感器的细菌检测，研究采用富集法减少检测线和时间。将待测液体积增加10倍并采用蠕动泵循环，可进一步降低检测基线。优化后，检测时间缩短至40 min，检出限低至10² CFU/mL。

最后，研究人员用饮用水、橙汁和牛奶样品验证了该方法的可行性。结果表明，使用该荧光传感器处理同一批样品后，用RGB值计算出的菌液浓度与平板计数的结果误差约为10%，相对标准偏差为2.059~5.518%，回收率为82.33%~92.77%，表明该检测策略具有较好的准确性和稳定性。与之前报道的其他方法相比，本工作应用传感器可实现真实样品中细菌的定量和定性分析，无需其他检测设备。

本研究成功开发了一种基于智能手机的简单荧光传感器，能够快速、灵敏地检测大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，且在40分钟内可定量检测浓度范围为1.0×10²至1.0×10⁸ CFU/mL。这项工作的主要创新在于独立设计的3D模型，旨在实现MIP和荧光探针对细菌的特异性吸附和检测。该三维模型涵盖了细菌检测的各个步骤，包括孵育、富集、分离、洗涤和检测。该传感器具有成本低、灵敏度高、专一性强、操作简便、响应迅速以及无需昂贵设备等优点，适用于果汁、牛奶和水中的目标细菌检测。然而，该传感器也存在一些局限性，例如测试样品类型较少，且检测过程尚未完全自动化。为提高实际应用效果，未来应扩大MIPs和荧光探针的种类，并优化检测面积和数量，以实现对更多细菌的同时检测。总体而言，该传感器为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的检测提供了一个有吸引力的替代平台，并为实际样品中多种靶点的检测提供了通用模型。

论文链接：https：//doi.org/10.1016/j.bios.2023.115744