基于分子印迹聚合物-适体双识别和纳米酶辅助光电化学-比色双模检测的通用传感平台

引言

准确高效检测小分子对于环境监测、食品安全、临床诊断、药物研究和工业优化至关重要。双模检测分析策略集成两种可切换检测模式，在各种检测环境(实验室或现场测试)下展现出优异的灵活性。双信号检测策略可提供内参校正，确保检测结果的高准确性和良好可靠性。

光电化学(PEC)系统受益于信号激发(光)和检测(光电流)分离。它具有低背景信号、高灵敏度和固有的小型化特点。比色法具有读数简单快速、实用可视的优点。因此,将PEC和比色法相结合可实现小分子的可视化和快速定量分析。

无论采用PEC还是电化学方法,识别元件和传感器结构在实现目标分子的准确和灵敏检测中起着关键作用。目前,抗体是构建生物传感器和生物分析的主导识别单元。然而,小分子由于分子量低,通常只有单一表位,这使得在三明治层析分析中与两个抗体同时结合具有挑战。此外,还存在检测流程复杂、成本高、筛选过程耗时以及普通抗体储存稳定性差等问题。因此,迫切需要开发高亲和力、高稳定性和低成本的抗体替代品。

分子印迹聚合物(MIPs)被视为具有特异性识别位点的人工抗体,其形状、大小和官能团与模板分子相补。此外,MIPs具有制备简单、成本效益好以及对极端条件(高温高压、强酸碱、有机溶剂等)适应性强的特点。这些特质使得MIPs成为有前景的抗体替代品。

本研究利用MIP和适配体的三明治识别策略，构建了一种用于检测小分子DBP的PEC-比色双模传感平台。纳米酶被修饰在适配体上以扩增信号。这种三明治结构结合了MIPs和适配体的优点，并提供了更高的设计灵活性，有效地克服了单分子识别策略的局限性。方案1描述了基于分子印迹层包被过氧化物酶模拟Fe₃O₄纳米粒子(Fe₃O₄@MIPs)-碱性磷酸酶模拟Zr -MOF标记的适体(Zr-MOF@Apt)三明治结构的纳米酶辅助双模传感平台的构建过程和检测机制。以DBP为靶模板，以多巴胺为单体，经多巴胺自聚合得到Fe₃O₄@MIPs。当目标DBP存在时，它将被Fe₃O₄@MIPs特异性捕获并预富集。随后，Zr-MOF@Apt鉴定了富集的DBP形成三明治结构(方案1A)。通过磁富集分离，可以去除可能产生假阴性结果的非靶标和未结合Zr-MOF@Apt。夹层结构中的Zr-MOF可以催化底物AAPS原位生成抗坏血酸(AA)，可以通过PEC和比色模式检测(方案1B)。在PEC模式下，使用具有p型半导体性质的CTAB@CH₃NH₃PbI₃作为光活性材料。将含AA的酶混合物转移到电极表面。由于AA作为空穴牺牲剂，它会消耗价带的光生空穴，从而降低CTAB@CH₃NH₃PbI₃的光电流信号。在比色模式下，DBP占据Fe₃O₄@MIPs的印迹空腔，从而降低了模仿过氧化物酶Fe₃O₄@MIPs的催化活性，抑制了显色反应中被催化的TMB。此外，生成的AA还有一个额外的优点，即诱导oxTMB的蓝色发生可识别的变化，无需专门设备即可进行视觉观察。这种特性有利于即时和方便的检测。采用PEC-比色双峰法对DBP进行了选择性好、灵敏度高的痕量检测。提出的双信号双识别策略有望推广为小分子的通用检测策略。

结果与讨论

1. 材料表征

透射电子显微镜(TEM)表征了Fe₃O₄、Fe₃O₄@MIPs和Fe₃O₄@NIPs的形貌。Fe₃O₄纳米颗粒呈均一的球形形态,平均直径约为234.62 nm。在Fe₃O₄表面聚合多巴胺形成了核壳结构,Fe₃O₄@MIPs的平均粒径为242.78 nm,印迹层厚约8 nm。XRD表明,印迹层未改变Fe₃O₄的晶体结构。FT-IR证实,DBP成功地被嵌入和萃取出Fe₃O₄@MIPs的印迹层。

TEM和XRD验证了Zr-MOF@Apt的形貌和结构完整性。UV-vis吸收光谱表明,大部分寡核苷酸已成功组装在Zr-MOF表面。FT-IR和XPS进一步确认了寡核苷酸与Zr-MOF的结合。

利用电位分析验证了夹层结构的形成。DBP诱导Zr-MOF@Apt和Fe₃O₄@MIPs组装形成三明治结构,电位有所上升。HR-TEM和EDS映射进一步证实了Fe₃O₄@MIPs和Zr-MOF@Apt-DBP的夹层结构。

2. 光电化学平台的表征

CTAB@CH₃NH₃PbI₃作为光活性材料,在可见光照射下产生阴极光电流。AA作为捕获空穴的牺牲剂,可显著降低CTAB@CH₃NH₃PbI₃的光电流信号。这证实了该光电化学平台对AA的灵敏响应。

3. 双模检测平台的可行性及分析性能

在无DBP存在时,光电流几乎不变。当存在目标DBP时,Zr-MOF@Apt与Fe₃O₄@MIPs形成夹层结构。Zr-MOF催化AAPS水解产生AA,导致光电流明显降低。这证明了只有当目标DBP存在时,夹层结构才会形成,AAPS才能被成功水解并产生信号报告分子AA。

通过检测TMB的颜色变化验证了夹层结构在比色分析中的可行性。Fe₃O₄具有优异的过氧化物酶样催化活性,氧化TMB产生蓝色oxTMB。Fe₃O₄@MIPs的催化活性略低于Fe₃O₄,可能是由于印迹层部分遮挡了Fe₃O₄纳米酶活性位点。当DBP被Fe₃O₄@MIPs选择性富集时,其过氧化物酶样活性受到抑制,TMB的颜色显示更浅。此外,Zr-MOF@Apt水解AAPS产生AA,可中和oxTMB颜色,呈现可视检测。

该双模平台对DBP浓度表现出良好的线性关系,PEC模式为1.0 pM至10 μM,比色模式为0.1 nM至0.5 μM。检测限分别为0.263 nM(PEC)和30.1 nM(比色)(S/N = 3)。双信号检测模式和夹层识别策略的集成,为小分子的灵敏准确检测提供了有前景的平台。该通用性检测策略有望应用于各种小分子的检测。

结论

本研究构建了基于MIP-寡核苷酸双重识别和纳米酶辅助的PEC-比色双模检测平台,用于小分子DBP的痕量检测。Fe3O4@MIPs作为识别元件,选择性富集目标DBP;Zr-MOF@Apt作为双功能材料,提供识别和信号产生。DBP诱导Zr-MOF@Apt和Fe3O4@MIPs组装形成夹层结构。Zr-MOF催化水解AAPS产生AA，调控PEC光电流信号和比色反应。该平台兼具高灵敏度、高选择性和可视读数的优势,为小分子检测提供了通用性检测策略。

参考文献

Shen, Y.-Z.; Xie, W. Z.; Wang, Z.; Ning, K. P.; Ji, Z. P.; Li, H. B.; Hu, X.-Y.; Ma, C.; Qin, X., A generalizable sensing platform based on molecularly imprinted polymer-aptamer double recognition and nanoenzyme assisted photoelectrochemical-colorimetric dual-mode detection. Biosens. Bioelectron. 2024, 254, 116201.