肽的生产与检测分析方式

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来源：苏悦

2024-10-12 15:36:30

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核心提示：多肽具有生物功能，可以作为激素（Hormones）、激素释放因子（Hormone-releasing factors）、神经递质（Neurotransmitters）等，广泛的功能多样性使多肽在全球生物技术行业具有重要的商业应用，这推动了高效、经济的生产、分离、纯化、鉴定和定量方法的发展，以揭示其在科学和生物技术产业中的应用潜力。

多肽具有生物功能，可以作为激素（Hormones）、激素释放因子（Hormone-releasing factors）、神经递质（Neurotransmitters）等，广泛的功能多样性使多肽在全球生物技术行业具有重要的商业应用，这推动了高效、经济的生产、分离、纯化、鉴定和定量方法的发展，以揭示其在科学和生物技术产业中的应用潜力。在改进多肽和蛋白质生物合成方法的同时，在多肽检测、分离、定量、纯化、氨基酸序列测定等方面也有了发展和改进。重组DNA技术（Recombinant DNA technology）产生的肽通常需要蛋白水解来产生片段，随后进行分析以确认所需肽的存在，并对纯化后的肽进行纯化和完全表征以确认其可靠性。利用该技术生产多肽的研究主要是利用细菌作为异源克隆（Heterologous cloning）和表达系统（Expression systems）。肽需要后期修饰时使用真核细胞。

噬菌体展示技术（Phage display technology）是噬菌体在其衣壳上产生并展示短肽或中等肽的一种变体，可用于肽筛选。胰岛素是由朗格汉斯岛的β细胞分泌的一种胰腺激素，可从猪和牛的胰腺提取分离供人类使用，然而，人类的过敏反应（由于人、猪和牛胰岛素氨基酸序列的结构差异）和对治疗胰岛素的高需求促进了大规模生产这种激素的新方法的发展。长期高血糖与心血管疾病、白内障和视网膜病变的风险增加有关。因为当哺乳动物血液中出现高血糖时，胰岛素刺激细胞摄取葡萄糖，这种寡肽已成功地用于治疗糖尿病。它已经成为一种具有巨大生物技术价值的激素。胰岛素由两条多肽链（A和B）组成;A链有21个氨基酸残基和一个链内二硫键， B链由30个氨基酸残基组成。链A和链B通过链间二硫键连接，胰岛素的分子量接近5kda。Frederick Sanger阐明了这种肽的复杂化学结构，于1958年获得诺贝尔化学奖，并开发了第一个揭示肽和蛋白质氨基酸序列的方法。人类胰岛素通过重组DNA技术生产，这种技术产生的重组激素不含非人类污染物。在一种克隆策略中，A链和B链分别表达和纯化，以便随后氧化半胱氨酸，从而形成二硫键。在另一种更有效的克隆策略中，利用大肠杆菌或酿酒酵母的异种宿主，A链和B链通过二硫键翻译后修饰(即胰岛素原)同时表达和连接。从发酵液中纯化胰岛素原后，进一步进行酶处理，去除C肽，生成成熟胰岛素。

如今，氨基酸分析的技术进步意味着该过程是完全自动化的，允许严格的再现性，优化灵敏度和分析时间。这种类型的分析在从天然和/或合成来源分离的生物活性肽和蛋白质的化学特性中尤为重要。分析水解液(由肽或蛋白质的总水解产生的氨基酸混合物)存在两种方法：水解液可以使用离子交换色谱（Ion exchange chromatography）进行氨基酸分离，随后衍生化以进行鉴定和定量（柱后衍生化，Post-column derivatization），或者水解液可以衍生化，随后分离、鉴定和定量（柱前衍生化，Pre-column derivatization）。在柱后衍生化中，氨基酸分离使用高效离子交换色谱（High-performance ion exchange chromatography, IEX-HPLC）在磺化聚苯乙烯柱上进行，使用pH值和离子强度增加的洗脱缓冲液。分离取决于氨基酸的酸碱性质和与聚苯乙烯基质的疏水相互作用。洗脱后，分离的氨基酸在管式反应器中加热至130℃与茚三酮溶液反应。衍生化染色产物可以在570 nm检测到，颜色的强度与氨基酸的浓度成正比。收集吸光度数据，并使用特定的软件生成色谱图（吸收与洗脱时间）。氨基酸鉴定是通过比较水解液成分的洗脱时间与标准溶液中的洗脱时间来实现的。通过将样品色谱峰下的面积插入到先前获得的每个标准氨基酸的标准曲线中，可以进行定量。

柱前衍生化是一种可以提高分析检测灵敏度的替代方法。采用RP-HPLC法对衍生氨基酸进行分离、鉴定和定量。检测利用紫外-可见区域的吸收和/或产生特定波长的荧光。肽或蛋白质水解物可以用IEX-HPLC分析，使用胺化柱(阴离子交换，anion exchange)。然后，采用直接电化学检测方法对氨基酸进行鉴定和定量。在这种方法中，色谱分离发生在高pH值12-13下，组分通过施加电压脉冲在金电极上氧化，这种氧化产生与测试溶液中氨基酸浓度成正比的电流。电流数据被发送到计算机，计算机记录并使用特定的软件整合峰面积，与氨基酸标准值进行比较。然后，可以在原始样品中确定溶液中每种氨基酸的量。