病毒基因组测序：当前方法的优势与挑战

引言

病毒基因组测序技术的发展为病毒学研究和公共卫生领域带来了革命性的变化。这项技术不仅加深了我们对病毒基因组功能和进化的理解，而且在病原体监测、流行病学调查和临床诊断中发挥着越来越重要的作用。随着测序技术的不断进步，病毒基因组学的应用范围和已编目的基因组数量持续扩大。

测序技术的演变与应用

1. 测序技术的发展

文章概述了从第一代Sanger测序到第三代长读长、单分子、实时测序技术的发展历程，特别强调了第三代测序技术在揭示病毒进化、传播网络和病理机制方面的优势。

图1 常用测序方法的基本原理

(A)链终止测序利用双脱氧核苷酸(ddNTPs)。ddNTPs在结构上与脱氧核苷酸(dNTPs)相似，但缺乏3’羟基。ddNTPs可以用放射性或荧光标记。当ddNTP与DNA链结合时，DNA合成就停止了。在测序反应中，dnntp过量存在，链延伸正常进行，直到DNA聚合酶添加标记的ddNTP，阻止延伸。(B)测序反应后，不同长度的产物通过凝胶(左)或毛细管电泳(右)分离，并可以通过放射自显影或荧光来推断DNA序列。(C) Illumina染料测序是第二代合成测序方法，涉及DNA输入片段，并将测序适配器连接到片段的末端。然后，这些片段可以通过适配器序列杂交到固体流细胞中，在那里它们被扩增成克隆簇，作为测序模板。测序反应包括荧光标记的dNTPs。当每个碱基被合并到新合成的链中时，流式细胞被成像，并记录每个簇的特定发射以识别新合并的碱基。荧光标记的核苷酸作为“可逆终止物”，因为标记可以在每次测序反应后被酶切，从而使下一轮dNTP结合成为可能。(D) SMRT HiFi测序是一种单分子长读测序技术。制作环状DNA片段，并在含有数百万个称为零模波导(zmw)的孔的纳米流控芯片上清洗。环状DNA的单个分子与DNA聚合酶(红色)相关联，并固定在ZMW的底部。从ZMW内部，标记的核苷酸被合并到新合成的链中。SMRT-seq使用在核苷酸的磷酸链上而不是在碱基上含有荧光标记的核苷酸。根据磷酸链裂解时释放的相关荧光团，实时检测纳入的核苷酸，以推断每个ZMW中的DNA序列。(E)纳米孔测序是一种直接实时的单分子长读测序方法。纳米孔流动细胞包含一组跨膜纳米孔(绿色)，嵌在抗电膜(蓝色)中。每个纳米孔连接到一个电极，电极可以测量流过纳米孔的电流。当核酸分子被解旋酶(海军蓝)引导通过纳米孔时，电流就会被打断，从而形成典型的“卷曲”。然后，利用基于神经网络的碱基调用算法，可以从卷曲的序列中实时推断出核酸序列。

2. 病毒基因组测序的应用

基因组组装：长读长测序技术有助于解决病毒基因组中的复杂区域和结构变异问题。

环境宏基因组学和病毒组学：用于探索未培养病毒的多样性，提供完整的病毒基因组信息。

病毒系统发育和分类：通过比较基因组序列，揭示病毒之间的进化关系。

插入位点映射：研究逆转录病毒如HIV的整合位点，理解病毒与宿主的相互作用。

基因组流行病学：监测病毒爆发和传播链，如SARS-CoV-2大流行期间的应用。

临床应用：用于病毒性疾病的诊断、治疗响应监测和药物抗性检测。

3. 技术挑战与局限性

测序错误和读长

第三代测序技术虽然提供了更长的读长，但错误率较高，需要通过算法和实验方法进行校正。

数据标准化和分析

需要标准化的数据处理流程和分析工具，以确保结果的准确性和可重复性。

成本和通量

尽管测序成本在降低，但不同技术的性价比和通量仍然是考虑因素。

表1 常见的第一代、第二代和第三代测序方法的比较

未来展望

文章认为，随着测序技术的不断进步和成本的降低，病毒基因组测序有望在临床和流行病学中得到更广泛的应用，但需要克服技术和数据分析方面的挑战。

结论

病毒基因组测序技术为病毒学研究和临床实践提供了强大的工具，但仍面临技术挑战和数据分析难题。未来的研究需要解决这些问题，以实现病毒基因组测序在更广泛应用中的潜力。

参考文献：

Jansz N, Faulkner G J. Viral genome sequencing methods: benefits and pitfalls of current approaches[J]. Biochemical Society Transactions, 2024: BST20231322.