基于硅藻土的生物模板 Janus 磁性微型机器人可高效检测沙门氏菌

食源性疾病每年导致数百万人的死亡，突显了监测致病菌的迫切需求。有效检测沙门氏菌尤为重要，因为它容易污染富含蛋白质的食品，如牛奶。尽管已有多种检测方法被开发，如培养法和生物传感器，但这些方法通常面临分析过程长、成本高和结果不准确等问题。因此，探索简单、快速且高特异性的检测策略至关重要。近年来，微/纳米机器人的快速发展为新型生物传感平台的构建提供了可能。这些微/纳米机器人能够将多种能量转化为流体中的推进力，其中磁驱动微/纳米机器人因其快速反应和精确控制而受到广泛关注。尽管已有研究展示了其在细菌检测中的应用，但现有的制造方法往往限制了其在低成本、大规模生产中的可行性。因此，开发具有良好性能的微型机器人，并探索其大规模、低成本的制造策略，对推动其在生物传感领域的应用至关重要。利用天然微生物作为生物模板，可以有效提高微型机器人的性能和功能，为细菌检测提供更好的解决方案。

基于此，中国农业大学的研究者以硅藻土为生物模板制备了一种新型的Janus圆盘形磁性微机器人(BJDM)，并验证了其高效的沙门氏菌捕获检测性能(方案1)。在硅藻土的基础上，在一侧溅射Ni和Au，另一侧保留完整的多级纳米孔表面形貌，构建了具有Janus结构的多功能磁性微机器人。BJDM不仅保留了硅藻土独特的表面形貌，而且具有优异的磁场驱动特性和群驱动特性。BJDM的多级纳米孔结构装载了大量适配体，具有特异性捕获沙门氏菌的能力。同时，与静态组相比，几种群体驱动模式大大提高了沙门氏菌检测效率，实现了微型机器人从细菌捕获到核酸吸附的全过程检测。

图1 主动捕获沙门氏菌的生物模板Janus圆盘形磁性微机器人(bjdm)的制备

在制备过程中，采用单层硅藻紧密堆积的方法将其均匀排列在硅片上，并通过吸附-解吸实验确认了其较大的比表面积。随后，在硅藻土表面沉积镍和金，并使用微针将BJDM从硅片上剥离，最后通过磁分离回收。扫描电镜（SEM）图像显示，BJDM的表面形貌保持完好，纳米孔结构未受损。能谱分析表明，BJDM的元素分布均匀，硅和氧源自天然二氧化硅，而镍和金则通过溅射均匀分布。

在制备完成后，BJDM的运动特性在磁场中进行了测试，采用三维亥姆霍兹线圈产生旋转磁场，并使用高倍率CCD摄像机进行观察。BJDM表现出翻滚和滚动两种主要运动模式，能够通过调整磁场参数导航任意轨迹。在去离子水和10%甘油溶液中，BJDM的运动速度与磁场强度和频率呈正相关，随着驱动频率的增加，速度逐渐提高，而甘油浓度的增加则减缓了运动速度。在20 Hz时，BJDM的运动模式从翻滚转变为滚动。研究表明，在一定的磁场强度下，BJDM的运动速度随着磁场强度的增加而加快。此外，在恒定甘油浓度下，随着磁场强度增强，BJDM的模式转变频率也随之提高。

图2。(a) BJDM运动模式示意图。(b) BJDM在两种不同模式下的运动图像。(c)控制BJDM沿矩形轨迹飞行。(d)不同磁场频率下磁场强度的关系(n = 3, mean±SD)。(e)磁场强度与BJDM运动速度的关系(n = 3, mean±SD)。(f) bjdm的转变频率与磁场强度的关系。

BJDM群体的有效推进显著提高了微机器人的富集和捕获效率。在研究单个BJDM的运动性能后，进一步探讨了BJDM群体的不同运动模式及其对流体速度和表面压力的影响。翻滚运动产生的扭矩使得BJDM外缘产生1.2 mm/s的流体速度，而在两倍于BJDM直径的高度处，最小速度为100 μm/s，流体速度差异可达12倍，有效加速流动。此外，在翻滚过程中，由于与流体的阻力，BJDM在流体中产生最大1 Pa的表面压力。

图3。BJDM群体的仿真与运动。(a)翻滚运动模式下蜂群对液体流动的影响。(b)群体翻滚运动时的表面压力变化。(c)滚动运动模式下蜂群对液体流动的影响。(d)群体滚动运动时的表面压力变化。(e) BJDM旋转模式，(f) BJDM遍历模式，(g) BJDM交叉模式图中的比尺为800 μm。实验参数为50g，频率为10hz。

BJDM群体的有效推进显著提高了微机器人的富集和捕获效率。研究表明，BJDM在液体中的运动模式包括翻滚和滚动，翻滚模式产生的流体速度是滚动模式的1.5倍，且翻滚模式下的压力变化比滚动模式大10倍，这使得翻滚模式更有利于流体扰动，从而增强捕获能力。此外，旋转磁场的方向对BJDM的推进力影响显著。在XOY平面上施加旋转磁场时，BJDM表现出旋转运动并形成微型机器人漩涡。在三维平面上，BJDM群体在磁场驱动下聚集并形成长链，这些链能够沿特定路径移动并捕获流体中的底物。

图4。(a)微型机器人探针结合机制示意图。(b)不同浓度下微机器人与适配体的结合效率图(n = 3, mean±SD)。(c)在外加磁场的影响下，微机器人与适配体在主动运动时的结合效率图(n = 3, mean±SD)。(d) Cy-5荧光标记的bjdm。(e)用SYTO-9染色的沙门氏菌被bjdm诱捕。(f)表示两个荧光通道的二色叠加图像。在50g的参数下，在10 Hz的自动模式下进行30 min的捕获实验，得到了结果。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001, t检验。

采用巯基与金结合的方法合成了靶向鼠伤寒沙门菌的核酸适体。通过在适体的5'端加入巯基修饰，使其与BJDM表面的金形成稳定结合，并在适体的3'端使用Cy-5荧光探针进行修饰，以定量表征结合效率。实验结果显示，当BJDM浓度为1 mg/mL、适体浓度为10 μM时，探针的负载效率最高，达到25.5%。在自动化编程运动下，BJDM显著提高了适体探针的结合量，尤其在(1 mg/mL, 10 μM)条件下，上样率达到59.0%。共聚焦显微镜观察到BJDM与适配体结合后呈现红色荧光，而成功捕获沙门氏菌后则显示绿色荧光。随后，通过磁场控制BJDM在旋转磁场中捕获沙门氏菌，并进行qPCR扩增，以定量验证捕获效率。

图5。(a) bjdm捕获沙门氏菌并吸附其DNA的过程。(b)不同模式下不同时间bjdm对沙门氏菌的捕获效率(n = 3, mean±SD)。(c)不同浓度bjdm对沙门氏菌的捕获效率(n = 3, mean±SD)。(d)不同浓度沙门氏菌的捕获效率(n = 3, mean±SD)。(e) bjdm的DNA吸附效率(n = 3, mean±SD)。(f)牛奶样品中沙门氏菌捕获实验(n = 3, mean±SD)。(g) bjdm和磁珠的磁分离和回收能力(n = 3, mean±SD)。(h) bjdms特异性捕获的电泳凝胶照片。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001, t检验。

在旋转模式下，BJDM群体的捕获效率随着时间的推移逐渐提高，最高可达31.4%。然而，由于微型机器人聚集在一起，限制了集体运动并降低了速度，从而影响捕获效率。在交叉和穿越模式下，前30分钟内捕获效率持续提高，其中交叉模式下捕获了85.82%的沙门氏菌，而穿越模式下为82.87%。BJDM的浓度显著影响捕获效率，最佳浓度为2 mg/mL，此时捕获效率达到峰值。随着沙门氏菌浓度的增加，微型机器人的捕获率也随之提高，而在没有磁场的对照组中，捕获率保持在10%以下。BJDM在5.8 × 102至5.8 × 105 CFU/mL范围内表现出良好的线性检测能力，最低检出限为58 CFU/mL。

此外，BJDM显示出良好的DNA吸附能力，在自动编程模式下，其核酸捕获效率为84.51%，显著高于静态对照组的5.87%。在牛奶样品中，BJDM有效捕获了58%的沙门氏菌，而对照组仅捕获了5%。磁分离实验显示，BJDM在PBS和牛奶中均表现出优异的回收率。最后，通过添加其他食源性病原体进行特异性测试，结果表明BJDM能够专一性地捕获沙门氏菌。

本研究成功开发了一种基于生物模板的Janus圆盘形磁性微型机器人（BJDM），能够高效捕获液体样品中的沙门氏菌。这种微型机器人通过核酸适体修饰，特异性结合沙门氏菌表面的碱基序列。为了评估BJDM对沙门氏菌的捕获特异性，我们使用了四种常见的食源性细菌作为阴性对照，并进行了混合实验，结果证明BJDM能够有效捕获沙门氏菌。此项技术具有定制化潜力，可以使用不同的适体捕获其他细菌或病毒病原体。此外，BJDM在牛奶样品中也表现出良好的捕获能力，能够有效检测沙门氏菌。由于BJDM具有较高的驱动性能和功能化能力，它不仅提高了检测效率，还降低了成本，适用于快速鉴定和定量分析沙门氏菌。总之，BJDM为细菌和病毒的特异性检测提供了一种有效工具，展示了其在食品安全领域的广泛应用潜力。

论文链接：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsami.4c09408