利用酶级联反应-扩增策略检测超低浓度细菌

图一：检测平台原理示意图

病原细菌对人类健康构成重大威胁，广泛涉及食品污染、疾病传播和环境污染，每年约有6亿人因此感染食源性疾病，导致大量死亡。由于病原细菌增长迅速，极低浓度（低于1 CFU/mL）也能引发感染，因此亟需开发快速、经济、简便的检测方法以提升公共卫生水平。传统平板培养法虽然灵敏度高，但耗时长、操作复杂，不便于实际应用。近年来，PCR、ELISA等方法虽取得一定进展，但在低浓度检测、设备需求和操作便捷性上仍有局限。超低浓度病菌检测的关键在于如何有效放大微弱信号，为此本研究开发了一种基于明胶酶响应的酶级联反应检测平台NFM@GNP@FITCs，具备良好的抗干扰性，检测灵敏度低至0.1 CFU/mL，时间缩短至14小时以内，适合水和奶等食品中的病原菌筛查。相比纳米颗粒形式，固态膜材料NFM@GNP@FITCs在存储和操作方面更便捷，具有广泛的商业应用潜力，为食品中超低浓度病原菌的检测提供了新的途径，意义重大。

该研究综合考虑了信号放大效率、响应速度、操作简便性以及材料成本四大因素，以优化细菌检测效果。具体来说，GNPs@FITCs作为均相系统中的检测材料，通过相反转法合成，在碱性条件（pH值约11）下获得最小水合直径(约401 nm)和最佳负电荷稳定性（zeta电位约为-27至-30 mV）。GNPs@FITCs在540 nm处具有最大荧光发射峰，其最大激发波长为470 nm，而NFM@GNP@FITCs则分别在530 nm和490 nm处达到峰值。此外，NFM@GNP@FITCs的膜表面形貌通过扫描电子显微镜（SEM）进行观察，以确保合适的加载量和膜表面覆盖完整性，最佳加载量在0.6 mg/cm²时，保证了膜的灵活性和均匀的荧光分布。在检测机理上，GNPs@FITCs在明胶酶催化作用下裂解，迅速释放荧光素，使信号放大效果显著增强。研究表明，荧光强度随明胶酶浓度增加而显著上升，且荧光强度的变化与细菌浓度呈正相关，证明细菌分泌的微量酶可以有效引发级联反应，放大检测信号。结果表明，该平台对0.1 CFU/mL浓度的细菌样品能够在14小时内实现显著信号响应，即使在复杂样品如水、奶等食品中也表现出优异的检测灵敏度和抗干扰能力。相比于传统纳米颗粒检测平台，NFM@GNP@FITCs作为固态膜具有优越的长效存储稳定性，且在操作中无需离心分离，显著简化了检测过程。此外，在酸性环境（如橙汁pH约3.91）中，由于荧光淬灭效应导致检测下限较高（约10 CFU/mL），但在中性和碱性环境下可达到<1 CFU/mL的灵敏度。相较于当前国家标准方法，该平台在无需大型仪器支持的情况下，仅需荧光光谱仪便可实现快速检测，为食品中超低浓度病原菌的筛查提供了更高效、经济的检测方式，有望在公共卫生和食品安全领域广泛应用。

图二：原理图显示GNPs@FITCs和NFM@GNP@FITCs的制作

该方法的核心在于利用病原菌分泌的明胶酶作为触发器（如图三），通过催化分解GNPs@FITCs释放荧光信号。为了实现超低浓度细菌的检测，采用了酶级联反应来放大微弱信号。检测过程中，FITC的释放速度主要由明胶酶的活性驱动，而细菌增殖水平则影响明胶酶的分泌量。然而，由于细菌的生长受到浓度、营养环境等多方面因素的影响，偶尔会出现低浓度细菌产生较高荧光信号的情况。因此，这种方法更适合用来快速识别样品中的细菌污染，而不适用于精确的浓度测定。

图三：NFM@GNP@FITCs的病原检测机制。(a)显示探测机制的示意图；(b)明胶酶溶液下FITC的释放动态；(c) NFM@GNP@FITCs与明胶酶溶液共培养后的表面形貌；(d)NFM@GNP@FITCs与明胶酶共孵育前后的表面红外光谱

综上所述，NFM@GNP@FITCs平台作为基于酶级联反应放大策略的超低浓度细菌检测工具，展现出显著的检测灵敏度和快速响应能力。通过利用病原菌分泌的明胶酶触发GNPs@FITCs解离释放荧光分子，该方法实现了对细菌极微浓度的信号放大，有效提升了检测效率（如图一）。实验表明，即使细菌污染低于1 CFU/mL，该方法也可定性检测出污染。此外，NFM@GNP@FITCs的固态膜结构在长期储存稳定性方面表现优越，且操作更加便捷，与传统方法和其他新兴检测手段相比具有时间和操作上的优势。此方法不仅为食品安全领域的病原菌筛查提供了一种灵敏、便捷的解决方案，同时为快速、低成本的细菌检测开辟了新的应用前景。这种平台将有助于更有效地保障公共卫生，并促进食品行业在微生物污染控制方面的技术进步。

原文doi：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c02560