通过微生物精密发酵生产蛋白及工厂量产可用的方法

牛肠内甲烷（CH₄）的排放因其对气候变化的重大贡献而受到全世界的关注，而动物数量的比例增加和利用土地生产更多蛋白质是不可持续的。丝状真菌和酵母作为主要的微生物工厂，通过微生物发酵重组生产的动物蛋白。某些牛奶和鸡蛋蛋白质以及通过精密发酵（Precision fermentation）生产的特定肉类蛋白替代品模拟成分已经进入市场。成本效益要求包括生产滴度高于50 g/L，比制药蛋白生产高出几个数量级，这使得菌株工程、工艺优化和扩大关键成功因素。另一种不同类型的替代蛋白质技术被称为动物细胞肉Animal-cell-based meat），涉及动物细胞的生物反应器培养。这项技术在可持续性和产品感官质量方面具有潜在的优势。真菌生物量即真菌蛋白（Fungal biomass, mycoprotein）是另一种替代蛋白质，可作为反刍动物肉类的高度可持续的未来替代品。基于Fusarium venenatum 或 Fusarium Flavolapis 大规模发酵的真菌蛋白已作为单细胞蛋白上市。Komagataella phaffii (Pichia pastoris）也可用于生产蛋白如鸡蛋白（Egg white protein）。更高的滴度和生产效率至关重要。工业规模上用于食品相关产品精密发酵的最常见菌种有芽孢杆菌（Bacillus），但目前主要是酵母和丝状真菌，包括黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）、K. phaffii （毕赤酵母, Pichia pastoris），酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），里氏木霉（Trichodermareesei)以及产油酵母（Yarrowia Lipolytica）。对于蛋白质的工业生产，丝状真菌表现良好，因为它们的高分泌能力，能够在廉价的底物上生长，以及充分的翻译后修饰(Post-translational modifications)。细菌和酵母菌，如大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒葡萄球菌，以其快速生长和全面的遗传工具箱（Genetic toolboxes）而闻名。然而，使用这些微生物可能会带来产量低等挑战。一旦选定了目标蛋白，并且表达正确基因结构的菌株显示出扩大规模的潜力，产量需要与所选菌株相关联，从小型微孔板规模到实验室试验，再到中试和更高的生产规模。对于真菌菌株，限制因素通常是在微孔板规模上的氧转移，这与典型的补料分批发酵非常不同。这些限制可以显著影响筛选过程中发酵菌株的选择，例如，不同的菌株背景和不同的遗传结构。精密发酵。该技术在食品技术领域定义了一种新型的研究和创新，重点是通过菌株选择和发酵技术优化产生超过50 g/L的蛋白质滴度。该技术商业可行性的一个关键方面是可扩展性。在工厂化生产中，沉淀（Precipitation）是一种用于从复杂混合物中分离特定蛋白质的操作，用于纯化微生物、动物或植物来源的蛋白质。沉淀导致不溶性蛋白质颗粒的形成，可以在固液分离操作中分离出来。通过分离和溶解沉淀的蛋白质聚集体，在纯化过程中易于减少待处理的介质体积，使沉淀操作成为纯化过程中高分辨率操作之前的传统步骤。沉淀法用于蛋白质、核酸和小代谢物的浓缩和纯化的优点是可以在工业规模操作中使用简单的设备，特别是连续操作，并且可以在中等浓度下使用大量低成本的沉淀剂。首先，通过改变溶剂来降低蛋白质的溶解度，例如，通过添加盐，如硫酸铵，有机溶剂，如乙醇，醚或丙酮，或非离子聚合物，如聚乙二醇（PEG）。第二种方法包括通过添加酸、碱、阳离子或阴离子沉淀剂或蛋白质与金属离子之间的直接相互作用来改变蛋白质的离子强度，从而降低蛋白质的溶解度。蛋白质的生物功能将在不损失的情况下被重建。溶剂始终是水性的，介质的性质可以通过离子强度、pH值的变化、可混溶的有机溶剂或有机聚合物的加入而改变，并且当与温度变化结合时，引起蛋白质溶解度的变化。蛋白质在水溶液中的溶解度受温度的影响。如果分几个步骤进行沉淀，就可以获得高分辨率的分离。此外，盐可以稳定蛋白质，防止变性、蛋白质水解或细菌污染。温度的升高有利于蛋白质的盐析沉淀，然而，优选在40℃下进行该过程，以减少由于蛋白酶的作用而使目标蛋白失活的风险。最合适的盐具有高溶解度，这增加了溶剂的表面张力，导致疏水区的水化水平较低，增加了这些区域之间相互作用的可能性。通过调节溶液的pH值，这是沉淀和纯化蛋白质最简单的方法之一。等电沉淀对于具有低水合常数或高疏水性表面的蛋白质更为明显，如球蛋白和酪蛋白。亲和沉淀包括将蛋白质结合到与蛋白质一起沉淀的配体上。这是一种有吸引力的方法，因为它结合了特定的亲和相互作用和大规模操作的便利性。在给定单元沉淀操作的放大过程中，沉淀剂及其浓度、pH值和温度应保持在实验室规模下的定义。挑战在于保持在实验室中获得的沉淀物的特征，如大小、密度和骨料中颗粒之间的结合程度，同时为扩大规模建立条件。

Figure 1.  Precision fermentation (derived from Nielsen, M. B., Meyer, A. S., & Arnau, J. 2024)

参考文献：

Nielsen, M. B., Meyer, A. S., & Arnau, J. (2024). The next food revolution is here: Recombinant microbial production of milk and egg proteins by precision fermentation. Annual Review of Food Science and Technology, 15.

Pessoa Jr, A., Kilikian, B. V., & Long, P. (Eds.). (2024). Purification of Biotechnological Products: A Focus on Industrial Applications. CRC Press.