基于噬菌体多功能探针的集成三信号生物传感器用于同时超灵敏检测单核增生李斯特菌的活/死

研究背景：食品中的致病菌污染是食品安全领域的重要问题。单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes，简称L.m）是一种常见的食源性致病菌，其检测对于保障食品安全具有重要意义。现有技术的局限性：传统的细菌检测方法，如平板计数、荧光染色、流式细胞术和聚合酶链反应，虽然准确，但耗时且劳动强度大，无法满足快速检测的需求。生物传感器在细菌检测中具有潜力，但常用的识别探针（如抗体、适配体、肽等）成本高、易受酸碱影响，且无法区分活细菌和死细菌。噬菌体作为一种生物识别元件，具有环境耐受性强、捕获效率高、稳定性好且成本低等优点，被广泛用于细菌检测领域。同时，普鲁士蓝纳米颗粒（PBNPs）等纳米材料具有优异的光热性能和过氧化物酶样活性，为构建多功能报告探针提供了新思路。本研究旨在利用噬菌体和纳米材料构建一种集成的三信号生物传感器，实现对食品中活菌和死菌L.m的同时超灵敏检测。

研究方法：利用噬菌体作为识别探针，通过酰胺反应将其与羧基功能化的PBNPs结合，制备成捕获/信号报告探针。集成生物发光信号（用于精确检测活菌）、光热信号和比色信号（用于现场测量总菌量）于一体的三信号生物传感器。

实验设计：

多功能探针的制备。噬菌体/聚乙烯亚胺@磁纳米颗粒（phage/PEI@MNPs）：通过静电吸附将噬菌体与PEI@MNPs结合，用于捕获和分离目标细菌。噬菌体/普鲁士蓝纳米颗粒（phage/PBNPs）：利用EDC/NHS偶联方法将噬菌体与PBNPs结合，作为信号报告探针。

生物传感器的构建。将噬菌体/PEI@MNPs和噬菌体/PBNPs结合，形成三明治结构，用于检测L.m。通过磁分离技术，将未结合的噬菌体去除，然后利用噬菌体的裂解活性、PBNPs的光热性能和过氧化物酶样活性，分别产生生物发光、光热和比色信号，实现对L.m的定量检测。

结论：通过SEM、TEM、FTIR等方法对噬菌体、MNPs、PBNPs以及多功能探针进行了表征，证实了噬菌体成功与MNPs和PBNPs结合。PBNPs表现出优异的光热性能和过氧化物酶样活性，可用于光热和比色信号的输出。确定了噬菌体/PEI@MNPs和噬菌体/PBNPs的最佳制备浓度、识别裂解时间等条件。构建的生物传感器能够同时检测L.m活菌和死菌状态，具有较高的灵敏度和特异性。对于活菌L.m，通过ATP-生物发光法进行定量；对于总菌L.m，通过PBNPs的光热和比色信号进行定量。实验结果表明，该生物传感器能够实现对L.m的超灵敏检测，且具有良好的稳定性和重复性。

应用前景：该多功能生物传感器在食品质量控制、食品安全监测以及食源性病原体污染控制方面具有广阔的应用前景。进一步优化生物传感器的性能，提高检测速度和准确性；探索更多类型的噬菌体作为识别探针，以扩大检测范围；以及将该技术应用于其他类型的细菌检测，为细菌检测提供了新的思路和方法。

(A)噬菌体/PBNPs信号探针的制备。(B)噬菌体/PEI@MNPs的制备。(C)具有三个输出信号的多功能信号探头L.m检测机制。

图1所示。PEI@MNPs (A)和(B) PBNPs的SEM图像。(C) PEI@MNPs、噬菌体/PEI@MNPs、PBNPs和噬菌体/PBNPs的粒径。(D) PBNPs、噬菌体、噬菌体/PBNPs、MNPs、PEI@MNPs和噬菌体/PEI@MNPs的ζ电位。(E) MNPs, PEI@MNP，噬菌体/PEI@MNPs和(F) PBNPs，噬菌体/PBNPs的FTIR光谱。

图2所示。(A) 808 nm激光（2.8 W⋅cm⁻²）照射10 min后水、PEI@MNPs和PBNPs的温度变化。(B)不同浓度PBNPs在808 nm激光照射4 min后的温度变化。(C) 808 nm激光照射前后PBNPs和PEI@MNPs过氧化物酶活性变化。(D)不同浓度PBNPs （0 ~ 50 mg/mL）通过TMB-H₂O₂比色反应介导的紫外可见光谱。

图3所示。多功能信号探针制备的优化，(A) PEI@MNPs和(B) PBNPs的浓度，(C)噬菌体/ PBNPs的识别时间。(D)噬菌体的裂解时间。

图4所示。(A)L.m1标准品（10³-10⁷ CFU/mL）温度与浓度的关系。（B， C）光热对L.m （10⁶ CFU/mL）与大肠杆菌、S.A、Sal、l.u anuii、l.g rei（10⁷ CFU/mL）的特异性比较。(D)响应信号ΔR（ΔR:R₀-R）与l-m在10²-10⁶ CFU/mL范围内的关系（附图：不同l-m浓度的生物传感器比色信号照片）。（E，F）与大肠杆菌、S.A、Sal、l.u anuii、l.g rei（10⁶ CFU/mL）相比，L.m的特异性为10⁵ CFU/mL。

图5所示。(A)生物发光示意图；(B)生物发光信号与浓度L.m（10² ~ 10⁶ CFU/mL）的线性关系。（C，D）通过与大肠杆菌、S.A、Sal、l.u anuii、l.g rei（10⁴ CFU/mL）的比较，对L.m1（10³ CFU/mL）的生物发光信号特异性。

https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2024.141495