引言

木质纤维素作为一种廉价且丰富的可再生资源，可以被微生物利用并转化为生物燃料等高值化学品。木质纤维素生物质炼制的最终目的是实现各种组分的绿色、低成本、高效转化。然而，在目前的生物质利用中，提高生物燃料生产和实现更具成本效益的木质纤维素生物转化是一项挑战。整合生物加工工艺(Consolidated Bioprocessing, CBP)是利用微生物在同一个反应器中完成酶制备、水解糖化及乙醇发酵和产物蒸馏的全过程，具有降低能耗并简化操作过程等优点。嗜热微生物因其耐高温、高效降解纤维素、共利用五碳糖六碳糖发酵产乙醇等生理特性受到广泛关注，且嗜热微生物CBP具备高效转化和降低成本的潜力。因此，利用嗜热微生物进行CBP是一种值得探索的木质纤维素生物炼制路线。

近期，山东大学微生物技术国家重点实验室倪金凤教授课题组和江苏大学环境与安全工程学院乐易林副研究员在Engineering Microbiology上发表了题为“Biofuel production from lignocellulose via thermophile-based consolidated bioprocessing”的综述文章，对嗜热微生物进行木质纤维素整合生物加工技术制备生物燃料的研究进展进行了总结与介绍。

01 背景

将木质纤维素类生物质转化为生物能源不仅是废弃物的资源化利用，还对我国能源安全和可持续发展具有重要意义。木质纤维素转化生物燃料涉及多个步骤，包括原料预处理、酶制备、糖化、发酵、以及产物蒸馏等。将糖化和发酵等反应步骤合并到一个反应器中进行的CBP技术，因其步骤简化，大大降低了木质纤维素转化的复杂性和生产成本，是木质纤维素高效转化值得探索的一个重要途径。常规微生物如大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、运动发酵单胞菌和梭状芽孢杆菌等通过代谢工程修饰可以改造为CBP宿主。与这些常温菌相比，一些嗜热微生物具有耐高温、高效降解纤维素、共利用五碳糖六碳糖发酵产乙醇等特点，改造嗜热微生物作为CBP宿主不仅可以将糖化和发酵等反应步骤合并到一个反应器，而且可以将产物蒸馏等过程整合到一个反应器中，进一步简化了反应过程。

02 耐热木质纤维素降解酶基因资源挖掘

木质纤维素生物质的生物冶炼涉及酶水解过程。嗜热菌来源的木质纤维素降解酶，如耐热纤维素酶、木聚糖酶和漆酶等具有出色的热稳定性。嗜热菌来源的木质纤维素降解酶基因资源可以通过多种方式获取，如分离筛选嗜热菌、宏基因组测序、定向进化、蛋白质工程等。表1列举了最近从不同环境中分离筛选的具有木质纤维素降解能力的嗜热古菌、真菌和嗜热细菌。

表1 | 从各种环境中分离出的木质纤维素降解嗜热菌

03 嗜热微生物作为CBP宿主及其代谢途径改造

适合高温发酵的CBP宿主包括嗜热纤维素降解厌氧菌(Caldicellulosiruptor bescii)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、解糖嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium saccharolyticum)等。在这些嗜热微生物中，嗜热纤维素降解厌氧菌(C. bescii) 是一种极端嗜热的纤维素分解细菌，能够在高达78-80°C的温度下进行发酵。嗜热纤维素降解厌氧菌高温发酵温度接近乙醇沸点，可以进一步将酶解、发酵和产物蒸馏在一个反应器中进行。表2 列举了Caldicellulosiruptor属来源的一些菌株代谢途径的优化改造。

表2 | 用于生物转化的工程化嗜热纤维素降解菌

04 嗜热菌遗传改造技术

嗜热菌高温乙醇发酵过程中乙醇产量低和嗜热菌对乙醇的耐受性低是目前面临的难题。利用遗传工程技术对嗜热菌进行途径改造可以提高木质纤维素降解效率和提高乙醇产量。针对嗜热菌遗传操作技术受限的问题，已经建立了以热稳定Cas9核酸酶为基础的CRISPR/Cas基因编辑技术。表3列举了目前在嗜热菌中建立的CRISPR/Cas基因编辑技术。

表3 | 一些具有代表性的嗜热菌的CRISPR/Cas基因组编辑技术

 展望

嗜热微生物作为CBP宿主将木质纤维素转化为生物燃料具有独特优势，包括简化操作过程、降低能耗、减少杂菌污染等。但天然嗜热菌高温乙醇发酵过程中存在乙醇产量低和嗜热菌对乙醇的耐受性低等难题。因此，利用嗜热菌CRISPR/Cas基因编辑等遗传操作技术，探究嗜热菌底物耐受机制，优化嗜热菌乙醇发酵途径和提高嗜热菌木质纤维素酶解效率等是未来重要的研究方向。随着耐热木质纤维素降解酶基因资源的挖掘，嗜热菌乙醇代谢途径调控机制的解析以及嗜热菌遗传操作技术的建立，利用合成生物学策略将可以构建一个能力强且稳定的嗜热菌CBP宿主(图1)。此外，嗜热菌高温发酵，将产物蒸馏等步骤整合到一个反应过程中，对传统发酵设备的升级改造以及发酵参数的优化至关重要。

图1 | 利用合成生物学策略构建嗜热菌CBP宿主