基于区分熔解峰的多重方法敏感检测17种高感染性细菌和病毒

高致病性病原微生物对人类健康构成严重威胁，包括鼠疫耶尔森菌、霍乱弧菌和伤寒沙门菌等引发的历史性大规模疫病，以及近年来流行的埃博拉病毒、猴痘病毒等高致死率病原体。尽管PCR和测序技术推动了病原体检测的发展，传统培养方法的低灵敏度与耗时长，以及现有分子诊断方法在多重目标检测中的局限性，仍难以满足对多种高致病性病原体的快速筛查需求。本研究设计了一种基于荧光PCR与熔解曲线的多重检测方法，通过引入碱基错配实现熔解峰温度差异，从而在单通道内实现多目标分辨，图1A为检测程序过程。在两管反应体系中，成功检测并分型17种高致病性病原微生物，包括9种病毒（如拉沙病毒、埃博拉病毒、猴痘病毒等）和8种细菌（如炭疽芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、布鲁氏菌等）。

Fig. 1 检测17种高度传染性细菌和病毒的实验流程示意图。图1A：在没有靶标存在时，fP和mP互补形成熔解曲线的过程。图1B：靶标存在时切割fP的过程；此时熔解曲线无法形成。负对照（NC）通过fP和mP互补形成熔解曲线来实现，因为没有靶标存在。负结果是没有靶标的情况，而正结果则是靶标存在的情况。在单一荧光通道上观察到三个熔解峰。

研究结合从质粒、工程菌及假病毒提取的核酸样本，优化了荧光探针和熔解探针的浓度（25-100 nmol/L），通过荧光信号和熔解曲线分析确定最佳条件。实验建立了20 µL PCR体系，使用优化浓度的引物和探针检测细菌和病毒目标，评估了灵敏度、多重检测能力，并在血液、拭子、土壤和污水等不同基质中测试了临床样本和人工合成样本，同时用数字PCR进一步验证目标质粒浓度，所有反应均重复三次以保证数据可靠性。这种结合荧光PCR和数字PCR的实验方法具有快速、灵敏和高精度的特点，可用于复杂样本中微量目标分子的检测。该方法通过引入碱基错配设计特异性熔解探针（mP），结合荧光探针（fP），实现单通道内多目标区分。研究中优化了fP与mP的浓度，以保证熔解曲线的峰值高度和特异性，同时确保不同通道间的信号强度一致性。在两管反应体系中，该方法成功检测并分型了9种病毒（如埃博拉病毒、猴痘病毒等）和8种细菌（如炭疽芽孢杆菌、伤寒沙门菌等）。熔解曲线特征峰（Tm）表现出极高的稳定性，跨实验的Tm波动范围小于1.2°C，有效提升了结果的准确性。图1B展示了在存在目标时，fP被切割的过程；此时无法形成熔解曲线。阴性对照（NC）是通过fP和mP互补形成熔解曲线，表明没有目标存在。阴性结果表示无目标，阳性结果表示目标存在。在单一荧光通道上，观察到三个熔解峰。该方法在单管中可同时区分9种病毒或8种细菌，最小检测限（LOD）为5–25拷贝/管。其中，大部分病原体的LOD为5–10拷贝/管，埃博拉病毒的LOD略高，为25拷贝/管，但仍具有较高灵敏度。尽管多重反应可能对部分目标的扩增效率产生一定影响，该方法在病原检测中的整体性能与单重qPCR相当。研究对173例真实和人工样本进行检测分析，包括临床拭子、血液、土壤和环境污水等多种基质样本。结果显示，该方法对阳性样本的符合率为99.35%，阴性样本的符合率为100%，总符合率达到99.42%。此外，在混合感染的样本中，该方法能够准确区分和检测多种病原体，验证了其多重检测的实用性。八种细菌通过fP和mP互补形成的熔解峰。黑线代表FAM荧光通道的结果，红线代表HEX荧光通道的结果，蓝线代表ROX荧光通道的结果（图2B）。

Fig. 2 fP和mP互补形成的FAM、HEX和ROX荧光通道的熔解峰。图2A：九种病毒在FAM、HEX和ROX荧光通道中由fP和mP互补形成的熔解峰。图2B：八种细菌在FAM、HEX和ROX荧光通道中由fP和mP互补形成的熔解峰。黑线表示FAM荧光通道的结果，红线表示HEX荧光通道的结果，蓝线表示ROX荧光通道的结果。

高致病性传染病的致死率极高，因此对其进行精确检测至关重要。本研究开发了一种方法，填补了当前临床检测的空白，可同时检测17种常见的高致病性病原体，包括8种细菌和9种病毒。该方法高效便捷，仅需2.5小时即可完成一个检测周期。值得注意的是，该方法对每种目标的最低检测限（LOD）可达每反应5至10个拷贝（扎伊尔型埃博拉病毒为每反应25个拷贝），其灵敏度与单一荧光PCR相当或更高。此外，即使同时检测8或9种目标，该方法仍能精确区分每种病原体，无误报情况，充分验证了多重检测的可行性。本方法的优势在于检测临床样本的成本效益高，对样本DNA提取的要求低，特别适用于资源有限的环境。该方法为出入境旅客样本检测提供了一种高效工具，同时满足了疾病预防控制中心（CDC）的流行病防控需求。因此，我们认为该多重检测方法在海关和CDC实验室的实际应用中具有重要价值，可助力应对传染病疫情。

原文doi：https://doi.org/10.1016/j.snr.2024.100237