基于氧化石墨烯的比色-荧光双模式免疫层析测定法，用于同时超灵敏检测复杂样品中的呼吸道病毒和细菌

常见的呼吸道病原体感染症状（如呼吸困难、发热和咳嗽）及其流行特征相似，因此，基于临床症状准确判断病原菌种类较为困难。鉴于细菌和病毒感染的治疗方法不同，及早准确地确定致病因子对于减少损失和挽救生命至关重要。然而，由于细菌和病毒的生物结构差异，单一核酸检测系统难以普遍适用于所有病原体。此外，目前的核酸检测操作繁琐、费用昂贵且耗时较长。因此，迫切需要一种快速、灵敏且能够同时检测呼吸道病毒和细菌的方法。近年来，各类新型信号纳米材料被引入ICA系统，以提高靶标的量化能力，但这些新型ICA生物传感器往往缺乏支持视觉测定的比色能力，并且需要额外设备进行信号测量，这限制了其在现场测试中的应用。为了解决这些问题，研究者们提出了一类双信号输出ICA技术，如比色/荧光双模ICA，以提供可见和可量化的信号，从而提高现场测试的灵活性。

基于此，中国科学院生物信息学中心的研究者提出了一种氧化石墨烯的比色-荧光双模式免疫层析测定法，用于同时超灵敏检测复杂样品中的呼吸道病毒和细菌。制备的GO-Au/QD-QD纳米片结合了氧化石墨烯优异的分散性和柔韧性、金纳米颗粒强烈的比色特性以及多层量子点出色的荧光特性，使其成为膜状双信号纳米标签，可用于ICA应用。方案1b和1c分别说明了免疫纳米片标签的制备和比色/荧光双信号输出ICA生物传感器的原理，适用于呼吸道病毒和细菌的现场同时检测。利用量子点壳层丰富的羧基，抗H1N1和肺炎链球菌抗体可以通过EDC/NHS化学有效地与GO-Au/QD-QD纳米片结合（方案1b）。在ICA检测中，将制备好的GO-Au/QD-QD免疫探针与目标样品直接混合并滴加于试纸样垫上。随着H1N1和肺炎链球菌浓度的升高，T线上的荧光和比色信号逐渐增强。

方案1 (a)双信号GO-Au/QD-QD纳米薄片的制备工艺，(b)免疫GO-Au/QD-QD纳米标签的制备，以及(c)同时超灵敏检测H1N1和肺炎链球菌的GO-Au/ qdqd ICA原理。

对合成的GO-Au/QD-QD纳米片的结构和化学性质进行了系统表征。首先，研究人员利用透射电子显微镜（TEM）观察了GO-Au/QD-QD纳米片在不同阶段的形貌。图1d展示了GO、GO-Au、GO-Au/QD和GO-Au/QD-QD纳米片的TEM图像。裸露的氧化石墨烯薄片呈现出柔性结构和近透明膜的特性（图1a）。之前的研究表明，阳离子聚合物PEI能够在带负电荷的纳米材料（如SiO2、Fe3O4和GO纳米片）上自组装，从而改变其表面电学性质。图S1显示，PEI修饰后氧化石墨烯纳米片的zeta电位从−36.9 mV增加到22.5 mV，表明GO-PEI的成功制备。在声波的驱动下，带负电荷的金纳米颗粒（AuNPs）通过静电相互作用牢固地吸附在GO-PEI表面，形成GO-Au薄片。图1b显示，16 nm的AuNPs均匀分布在GO-PEI纳米片表面。此外，通过密度泛函理论（DFT）计算揭示了PEI包覆氧化石墨烯对Au吸附能力增强的机理。经过结构优化后，Au与GO和GO-PEI纳米片的结合能分别为-2.75 eV和-4.65 eV，这表明PEI确实增强了GO对Au的结合能力。Au原子能够平行吸附在PEI表面，因此，PEI包覆的氧化石墨烯比单独氧化石墨烯更容易稳定Au。剩余的PEI位点可以继续吸附羧化量子点，从而形成具有AuNPs和量子点混合层的GO-Au/QD纳米片（图1c）。通过反复反应形成第二层包覆量子点，最终制备出GO-Au/QD-QD纳米片。图1d显示，在吸附第二层量子点后，GO-Au/QD-QD表面聚集了更多量子点，形成典型的多层纳米膜。进一步观察放大后的TEM图像（图1e-g），显示了GO-Au、GO-Au/QD和GO-Au/QD-QD的详细表面形貌，清晰地表明GO表面被均匀覆盖了直径约为16 nm的AuNPs，并且这些AuNPs上覆盖有大量直径为12 nm的CdSe@ZnS量子点。

图1 合成的GO-Au/QD-QD纳米薄片的表征。(a) GO, (b) GO- au, (c) GO- au /QD, (d) GO- au /QD-QD纳米片的TEM图像。部分(e) GO-Au、(f) GO-Au/QD和(g) GO-Au/QD-QD纳米薄片的放大TEM图像。(h) GOAu/QD和(i) GO-Au/QD-QD纳米薄片上吸附的AuNPs和CdSe@ZnS量子点的HRTEM图像。(j) GO-Au、(k) GO-Au/QD和(l) GO-Au/QD-QD纳米薄片的SEM图像。(m) GO-Au/QD-QD纳米片的HAADF-TEM图像和(n) GO-Au/QD-QD纳米片的EDS元素（C, Au, Cd, Se, Zn， S）映射图像。

如图2a所示，在阳光下，GO和GO-PEI均呈淡黄色，表明PEI涂层未影响GO的颜色。通过包覆16 nm的金纳米颗粒（AuNPs）作为显色组分，与氧化石墨烯溶液相比，氧化石墨烯-金纳米片呈现出紫红色。在第一层和第二层量子点吸附后，GO-Au/QD和GO-Au/QD-QD的颜色依然保持紫红色，表明其比色能力不受量子点的影响。紫外可见光谱结果（图2b）显示，负载AuNPs的氧化石墨烯纳米片（GO-Au、GO-Au/QD和GO-Au/QD-QD）在538 nm附近均有强吸收峰，而氧化石墨烯和GO-PEI在该区域没有吸收峰。这表明双信号纳米片的紫外吸收是由AuNPs内层的等离子共振激发引起的。图2a和c中的荧光照片及荧光光谱表明，仅包覆量子点的纳米片能够产生明显的红色荧光，且含有更多量子点的GO-Au/QD-QD比GO-Au/QD发出更强的荧光。研究还探讨了GO-Au/QD-QD纳米片在恶劣环境下的胶体稳定性和光学稳定性。如图2e-f所示，双信号GO-Au/QD-QD纳米片在pH范围为1-14的水溶液和高盐样品（0-1000 mM NaCl）中表现出优异的胶体稳定性及比色信号稳定性。

图2 双信号GO-Au/QD-QD纳米片的性质(a) GO、GO- pei、GO- au、GO- au /QD和GO- au /QD-QD纳米薄片的照片，(b)紫外可见光谱，(c)荧光发射光谱。(d) GO- au、GO- au和GO- au /QD-QD纳米片的DLS分布。(e) GO-Au/QDQD纳米片在不同pH水溶液中的比色和荧光稳定性。(f)不同盐浓度（0-1000 mM NaCl）下GO-Au/QD-QD纳米片的比色和荧光稳定性。

如图3a所示，当样品中同时含有两个目标时，GO-Au/QD-QD-ICA条带在自然光下呈现出两条紫色T线，而在紫外光下则显示出两条明亮的荧光T线。仅含肺炎链球菌或H1N1时，试纸条只出现一条紫色和荧光T线，而不含目标病原体时未出现假阳性信号。研究人员利用商用荧光条带读取器同时测量ICA条带两条T线的荧光强度（图3b），结果表明肺炎链球菌与H1N1抗体之间不存在交叉反应，为同时定量检测H1N1和肺炎链球菌提供了依据。图3c-e分别展示了阳性试验和阴性对照的试验区内部形态，SEM图像清晰显示病毒检测区域存在许多薄膜状的GO-Au/QD-QD纳米片，而阳性样品的细菌检测区域则显示出肺炎链球菌-GO-Au/QD-QD复合物。相比之下，空白对照区域没有GO-Au/QD-QD纳米片（图3e），进一步证实了生物传感器的可靠性。

图3 (a)不同浓度H1N1和肺炎链球菌感染下GO-Au/QD-QD-based ICA的照片和(b)对应的荧光强度（T线）：(1)106拷贝/mL， 104细胞/mL；(2) 0拷贝/mL， 104细胞/mL；(3) 106拷贝/mL， 0个细胞/mL；(4) 0拷贝/mL， 0细胞/mL。(c) 106个拷贝/mL H1N1， (d) 104个细胞/mL肺炎链球菌，(e)空白对照（仅PBS）时相应测试系的典型SEM图像。(f) H1N1和(g)肺炎链球菌抗体在两条T线上浓度的优化。(h)基于GO-Au/ qd - qd的ICA条带在PBST中FBS比例的优化。误差条表示从三个独立测试中计算出的标准偏差。

研究人员评估了基于GO-Au/QD-QD的免疫层析（ICA）方法在同时检测甲型H1N1流感和肺炎链球菌方面的性能。H1N1病毒和肺炎链球菌样品的精确浓度分别通过数字滴定聚合酶链反应（ddPCR）和平板菌落计数法测定（见图S10-S11）。采用梯度稀释法制备不同浓度样品（H1N1: 0 ~ 10^7 copies/mL，肺炎链球菌：0 ~ 10^5 cells/mL），并在优化条件下测定灵敏度。图4a-b显示了同时检测H1N1和肺炎链球菌时测试条的比色和荧光图像，结果表明，随着H1N1和肺炎链球菌浓度的增加，两条T线上的紫红色比色信号和红色荧光信号逐渐变深变亮。在5 × 10^4 copies/mL（H1N1）和5 × 10^2 cells/mL（肺炎链球菌）浓度下，T线上的紫红色比色信号可用肉眼分辨。

与传统胶体金ICA法相比，GO-Au/QD-QD-ICA在比色模式下同时检测H1N1和肺炎链球菌的灵敏度提高了10倍，传统方法的检测限分别为5 × 10^5 copies/mL和5 × 10^3 cells/mL。GO-Au/QD-QD-ICA在浓度为10^4 copies/mL（H1N1）和10^2 cells/mL（S. pneumoniae）时，T线上可见荧光信号。在相同条件下，GO-QD-ICA未显示比色信号，而其荧光信号仅为GO-Au/QD-QD-ICA的二分之一。通过读取T1和T2细胞系的荧光强度并绘制浓度对数函数（图4d-e），结果显示两种T系的荧光强度具有较宽的动态范围，相关系数（R²）分别为0.994和0.999。根据拟合曲线，GO-Au/QD-QD-ICA同时检测H1N1和肺炎链球菌的LOD分别为891拷贝/mL和17个细胞/mL，而GO-QD-ICA的LOD则为10^4拷贝/mL和10^2细胞/mL。上述结果表明，GO-Au/QD-QD-ICA在灵敏度上显著优于传统胶体金ICA及GO-QD-ICA，展示了双信号模式生物传感器在扩大ICA应用范围方面的潜力。

图4 (a)自然光和(b)紫外光下运行缓冲液中同时检测H1N1 （T1）和肺炎链球菌（T2）的基于GO-Au/ qd - qd的ICA条照片。(c)同时检测H1N1和肺炎链球菌的GO-Au/ qd - qd - ICA条带（上）和go - qd - ICA条带（下）T区的详细荧光强度。基于GO-Au/ qd - qd的ICA试纸对(d) H1N1和(e)肺炎链球菌的相应校准曲线。同一肺炎链球菌/H1N1样本的(f)基于go - qd的ICA条和(i)基于aunps的ICA条照片。基于go - qd的(g) H1N1和(h)肺炎链球菌的ICA试纸条对应的校准曲线(i)基于aunps的照片

研究人员采用所建立的GO-Au/QD-QD-ICA方法检测固定浓度的H1N1和肺炎链球菌在痰液、湖水和物体表面样品中的存在。比色和荧光图像及相应的荧光强度变化如图5a-c所示，结果表明比色和荧光信号的变化与样品中相应浓度的变化一致。GO-Au/QD-QD-ICA在同时检测H1N1和肺炎链球菌时，其平均加样回收率分别为89.2%至104.0%和91.2%至107.0%。此外，回收率的相对标准偏差（RSD）值在3.0%至8.0%之间。这些结果表明，该方法在不同样品中的检测性能良好，具有较高的准确性和可靠性。

图5 基于GO-Au/ qd - qd的ICA试纸条在真实环境和临床样品(a)痰液、(b)湖水、(c)物体表面同时检测H1N1和肺炎链球菌的检测性能。

本研究成功开发了一种基于GO-Au/QD-QD的膜状双模ICA生物传感器，用于在真实环境和生物样品中超灵敏地多重筛选H1N1和肺炎链球菌。该创新的GO-Au/QD-QD纳米膜由四个功能域组成：(i) 300-500 nm的氧化石墨烯纳米片作为柔性载体，提供优异的稳定性和分散性；(ii) 一层密度控制的金纳米颗粒（AuNPs）产生强烈的比色信号；(iii) 层间和外壳的两层量子点提供优越的荧光信号；(iv) 表面共轭抗H1N1和肺炎抗体，能够有效结合目标病毒和细菌。基于高效GO-Au/QD-QD标签，所建立的双模ICA方法能够实现H1N1和肺炎链球菌的快速筛选（比色法）和定量检测（荧光法）。此外，双模ICA在真实环境样本（如湖水和物体表面）以及临床样本（如痰液）的检测中也展现出优异性能。这表明该方法在包括病毒和细菌在内的呼吸道病原微生物现场检测方面具有巨大的实用潜力。通过结合比色与荧光信号，该传感器不仅提高了检测灵敏度，还扩展了其应用范围，为即时疾病监测提供了新途径。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2023.132192