膜锚定聚集诱导发射发光剂：防龋治疗中变形链球菌的准确标记和高效光动力灭活

细菌感染是全球健康损失的重要原因，长期以来被视为公共卫生的重点。在口腔健康方面，微生物发挥着关键作用。龋齿是一种常见的慢性传染病，主要由微生物引起，并与牙菌斑微生物群的生态失调有关。变形链球菌（S. mutans）因其优越的生物膜形成能力、酸产出及耐酸特性，与龋齿密切相关。这些细菌嵌入细胞外聚合物质（EPS）基质中，形成生物膜，为细菌附着和共粘附提供结合位点，促进了与其他酸性细菌的协同作用，导致局部酸化。此外，生物膜中的病原体通常对抗生素具有抵抗力，因此需要更高浓度和更长时间的抗生素治疗，从而增加了抗药性的风险。因此，创新的方法对抗这些复杂的微生物生态系统显得尤为重要。传统的抗菌方法在解决这些问题上面临挑战，而光动力疗法（PDT）因其可控性和低副作用而受到关注。PDT利用光敏剂产生高毒性活性氧（ROS），有效地失活目标微生物，并避免了耐药性的产生。

基于此，中山大学光华口腔医学院的研究者提出了设计并构建了三种小分子AIEgens，以评估其在荧光成像、抗菌及抗生物膜能力方面的可视化效果，尤其是在体内的抗肿瘤性能。通过不同的供体分子工程策略合成的这些AIEgens，成功开发出一系列有效的抗变形链球菌药物，从而降低龋齿发病率。AIE特性及其与细菌的静电结合显著增强了其染色能力。这些AIEgens在光照下有效产生单线态氧，展现出卓越的杀菌和抗生物膜能力。机制研究表明，膜锚定促进了AIEgens对细菌细胞膜功能的破坏。在啮齿动物模型中，一种AIEgen显著降低了龋齿病变的数量和严重程度，显示出其在控制和预防龋齿方面的可靠生物安全性。

摘要图1 AIEgens对细菌的精确标记和光动力失活的说明

如图1b−g所示，这些污染物在纯DMSO溶液中表现出较弱的发射。然而，随着稀DMSO/甲苯混合物中甲苯比例（f tol）的增加，发射强度逐渐增强。当甲苯比例达到95%时，CTPY和TDTPY的发射峰值在630至714 nm之间达到最大值，其荧光强度分别比纯DMSO溶液高出约11.5倍和6.0倍。CDTPY的发光强度在其浓度达到80 vol %时也达到了峰值，发射峰位于643 nm。这些PL行为验证了AIE在良好和差溶剂中的典型特征。通过对CTPY、CDTPY和TDTPY的紫外-可见吸收光谱分析（图1h），发现TDTPY的吸收峰约在496 nm，CTPY和CDTPY的吸收峰则分别位于432 nm和460 nm。为了评估这些AIEgens的ROS生成能力，测量了总ROS以及单线态氧（1O2）和羟基自由基（•OH）的生成。如图1i所示，在白光照射下（25 mW/cm²，150 s），CTPY、CDTPY和TDTPY的荧光强度显著增加，分别增强了49.4倍、36.6倍和42.6倍。这表明这些合成的AIEgens在ROS生成能力上超越了市售光敏剂Ce6。此外，378 nm处的吸收峰减小，进一步证明了其有效性。

图1 (a)合成氧的化学结构。（b, e） CTPY, (c, f) CDTPY, (d, g) TDTPY PL光谱及其与DMSO/甲苯混合物中甲苯组分的比值图。(h) AIEgens在纯DMSO中的吸收光谱。(i)由DFCH监测的白光照射（25 mW/cm²）下AIEgens的ROS生成。(j) ABDA监测AIEgens光致¹O₂生成A/A0随辐照时间的变化图。(k)优化了B3LYP/ 6-311G*水平下CTPY、CDTPY和TDTPY的S1几何形状和分子轨道计算。

受AIE特性的启发，研究者探讨了这些化合物对口腔致病菌S. mutans的浮游细菌和生物膜的染色能力。如图2a所示，经过15分钟的孵育，所有三种AIEgens在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）下均能清晰显示细菌。荧光图像与亮场图像叠加时，两者中的细菌符合率接近100%。AIEgens与S. mutans共孵育后的PL光谱进一步证实了其结合能力。为了验证AIEgens对其他细菌的结合行为，研究还考察了革兰氏阴性菌P. gingivalis和真菌C. albicans。结果显示，P. gingivalis仅表现出弱荧光，而C. albicans几乎无法被染色，表明AIEgens对革兰氏阳性菌的选择性作用。随后，对变形链球菌生物膜进行染色，观察到在生物膜成像中出现致密的红色荧光（图2b）。共定位实验利用Hoechst 33342作为核酸染料，结果显示红色AIEgens主要标记细菌表面，而蓝色Hoechst 33342则局限于细菌内部（图2c），表明AIEgens有效地融入细菌膜中。这种膜锚定现象展示了AIEgens在革兰氏阳性细菌中的优越结合能力。

图2 (a)变形链球菌浮游细菌和AIEgens染色生物膜。(b)三维生物膜中具有代表性的单层变形链球菌染色图像。(c)用TDTPY和Hoechst 33342染色的变形链球菌的定域图像。

首先，通过琼脂平板上菌落形成单位（CFU）计数评估了TDTPY的光动力杀伤效果。结果显示，在光照条件下（25 mW/cm²，10分钟），1.25 μM的TDTPY显著降低了S. mutans的CFU（图3c）。相比之下，在相同浓度的黑暗条件下，平板上的菌落数量未见明显减少。随着TDTPY浓度的增加，光照下的菌落几乎变得不可见，而较高浓度则显示出增强的暗毒性，导致菌落逐渐减少。在光照下，1.25 μM时CFU的抑制率达到98.3%（图3d，P < 0.001），而在黑暗条件下5 μM时抑制率为96.1%。与最小抑菌浓度（MIC）实验结果一致，TDTPY对L. casei也表现出优良的瞬时光动力杀灭效果，而对其他共生物种无明显损害。这些结果表明，TDTPY对致龋菌具有选择性抑制作用。为观察变形链球菌与AIEgens孵育后光照射的形态变化，进行了扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）实验（图3e和图3f）。结果显示，单独光照或1.25 μM TDTPY处理后的细菌形态完整，而在白光照射下，细菌形状发生显著改变，细胞膜明显下沉，表明AIEgens对细菌细胞膜造成了破坏。

图3 (a)各抗原对变形链球菌的MIC。(b)鲜兔血液中TDTPY的溶血分析。(c)加或不加TDTPY孵育的琼脂板上的变形链球菌照片。(d)在BHI琼脂上评估相应的变形链球菌CFU还原率。(e) TDTPY （1.25 μM）和白光（25 mW/cm²）辐照前后浮游变形链球菌的SEM图像。(f)变形链球菌的TEM图像。

为了进一步探索AIEgens的潜在抗菌机制，我们以监测变形链球菌细胞内ROS水平为指标。在光照射后，在图4a中观察到荧光强度急剧增加，表明AIEgens能够诱导细菌细胞内产生ROS （P < 0.001）。这些细胞内ROS可能会破坏细菌的正常代谢功能，最终导致细菌死亡。此外，通过CLSM捕获的膜结合现象可以观察到，抗菌效果可能与膜破坏机制有关。细菌膜破裂引起膜电位去极化，增强荧光强度的蛋白在tdtpy介导的光照射后增加（图4e， P < 0.05）。如图4f所示（P < 0.001），细菌呼吸链的活性也受到了明显的限制。这些结果共同表明，在tdtpy介导的PDT过程中，产生了大量的ROS，细菌膜被破坏，导致细菌内容物泄漏，并且呼吸链被抑制。这些因素阐明了AIEgens在白光照射下强劲的抗菌性能。细菌膜是至关重要的组成部分，为细胞稳态提供选择性通透性，促进代谢能量转导。膜是重要生理过程的场所，如营养物质和废物的主动运输、细菌呼吸、与呼吸酶相关的质子动力的建立、ATP的产生和生物膜内的细胞间通讯因此，设计破坏细菌膜的药物或方法被证明是一种有效的抗菌策略。如前所述，aigens通过静电相互作用与细胞膜结合，产生高效的¹O₂，这是一种高效的ROS值得注意的是，PSs及其活性位点的定位是影响PDT效率的另一个关键因素，这主要是由于10o2的有效范围为2.36，在生物系统中，10o2通常会在20 nm半径内立即导致细胞破坏，其寿命约为40 ns在实现膜锚定后，¹O₂分子可以与各种生物分子发生反应，包括蛋白质中的氨基酸残基（如色氨酸）、核酸碱基（特别是鸟苷和鸟嘌呤衍生物）和不饱和脂质（如胆固醇）。因此，这些相互作用可以通过细胞膜损伤导致细菌死亡，这使得这些发现非常重要。

图4 (a) DCFH-DA测定的变形链球菌体内ROS水平。(b) TDTPY处理下变形链球菌的膜电位变化。（c, d）经TDTPY处理的变形链球菌胞外ATP和胞内ATP水平。(e) TDTPY对变形链球菌蛋白渗漏的影响。(f)有或没有光照射（25 mW/cm²）的TDTPY对细菌呼吸链活性的影响。

考虑到变形链球菌常以生物膜形式引起龋病，研究者深入探讨了AIEgens光动力处理对生物膜形成的抑制潜力。采用结晶紫法评估其对变形链球菌生物膜形成的影响。结果显示，CTPY和CDTPY在光照与否的情况下，随着AIEgens浓度的增加，生物膜生物量呈剂量依赖性减少（图5a-c，**P < 0.01, ***P < 0.001）。在光照条件下（25 mW/cm²，10分钟），1.25 μM浓度分别使生物膜形成减少72.9%和72.8%。在2.5 μM浓度下，无论光照还是黑暗条件下，生物膜的还原率均接近80%。相比之下，TDTPY表现出独特的光敏剂特性，在光照条件下，其1.25 μM和2.5 μM的抑制率分别为69.6%和79.3%，而在黑暗条件下则无明显抑制作用。利用CLSM和SEM研究了变形链球菌生物膜的形态特征（图5d和图5e）。在TDTPY介导的光照射下，生物膜微结构呈簇状分布，活菌数量明显减少。进一步检测显示，经过1.25 μM TDTPY处理后，不溶性外多糖含量降低69.6%（图5f，P < 0.001），乳酸产量下降75.1%（图5g，P < 0.001）。这些结果表明TDTPY能有效抑制变形链球菌生物膜的形成及其毒力因子的表达。

图5 （a−c）经过或不经过AIEgens和白光照射（25 mW/cm²）处理的变形链球菌生物膜的结晶紫测定。(d) CLSM监测的生物膜中细菌的活/死染色。(e) TDTPY（1.25 μM）和白光（25 mW/cm²）辐照前后浮游变形链球菌的SEM图像。(f)光照射（25 mW/cm², 10 min）下变形链球菌生物膜的乳酸产量。(g)用蒽酮-硫酸比色法检测不溶性多糖。（h, i）TDTPY（1.25 μM）处理S. mutans毒力因子示意图及相对RNA表达

为了进一步验证AIEgens在体内的防龋效果，研究者们建立了大鼠龋病模型（图6a）。变形链球菌等产酸菌诱导的牙齿脱矿是评估龋齿严重程度的重要指标，采用Micro-CT进行评估（图6b）。矢状面切片显示，经过TDTPY介导的光动力治疗后，牙齿的脱矿程度最低，脱矿面积最小。为了直观评估大鼠龋病情况，使用0.4%紫铵对半切磨牙进行染色（图6c）。结果显示，CHX和TDTPY未显著改善龋齿预防或治疗效果，而AIEgens介导的光动力治疗则表现出有效的治疗效果。采用Keyes评分量化龋损程度，分为四个级别：仅牙釉质(E)、轻度牙本质(Ds)、中度牙本质(Dm)和广泛牙本质(Dx)。根据Keyes评分建立了全龋、初龋和中度龋三个等级。结果表明，与其他组相比，TDTPY介导的光动力治疗显著降低了病变发生和严重程度（图6d，*P < 0.05, ***P < 0.001）。

图6 (a) TDTPY啮齿动物龋病模型建立及抗龋治疗示意图。(b) Micro-CT大鼠磨牙矢状面，白色箭头为脱矿切片。(c) 0.4%紫铵染色大鼠磨牙图像，白色箭头表示龋齿病变。(d)采用Keyes评分法对沟段切片进行统计分析，判断龋齿的范围和深度。

本研究成功合成并开发了一系列简单而有效的抗变形链球菌的抗菌药物，从而降低了龋齿的发病率。AIE的特性及其与细菌的静电结合显著地促进了其优异的染色能力。这些AIEgens，由于它们在光照射下有效的单线态产氧，表现出出色的杀菌和抗生物膜能力。进一步的机制研究表明，膜锚定促进了AIEgens破坏细菌细胞膜功能。在啮齿动物模型中，其中一种AIEgens显著降低了龋齿病变的数量和严重程度，表明有效控制和预防龋齿具有可靠的生物安全性。这些发现为开发具有综合检测和治疗功能的多功能材料在龋齿治疗中的临床应用提供了见解。

论文链接：https://pubs.acs.org/10.1021/acsami.4c04585