乳酸代谢在哺乳动物细胞的生物加工中起着至关重要的作用，影响细胞的性能和生产力。从乳酸生产到消费的转变，被称为乳酸代谢转移，是非常有益的，并已被证明可以延长培养寿命和提高生产力，但其分子驱动因素仍然知之甚少。近期，曼彻斯特大学科学与工程学院Alan Dickson团队在《Metabolic Engineering》上发表了题为“Deciphering molecular drivers of lactate metabolic shift in mammalian cell cultures”的研究成果。研究人员通过两个案例研究，探索了支持这种代谢转变的机制，阐明了环境因素和遗传驱动因素。研究人员在过程、代谢和转录组水平上对这些研究案例进行了描述。研究人员的研究结果表明，谷氨酰胺消耗与乳酸代谢转移的时间相吻合，显著影响细胞生长、生产力和整体代谢。转录组分析揭示了ATF4通路的动态调控，参与了氨基酸（饥饿）反应，其中谷氨酰胺缺失激活ATF4基因及其靶点。通过过表达和下调实验操纵ATF4的表达，发现谷氨酰胺和乳酸的代谢发生了显著变化，影响了细胞性能。过表达ATF4增加了细胞生长和谷氨酰胺消耗，促进乳酸代谢转移。相反，ATF4下调降低了细胞增殖和谷氨酰胺摄取，导致乳酸的产生，而没有任何乳酸转移的迹象。这些发现强调了ATF4在调节谷氨酰胺和乳酸代谢中的关键作用，与CHO细胞培养过程中的阶段模式有关。这项研究为乳酸代谢转移过程中的代谢重编程以及在培养过程中决定细胞状态的分子驱动因素提供了独特的见解。

关键发现

1、 乳酸代谢转移与谷氨酰胺耗竭相关

图1 比较不同乳酸代谢状态下的哺乳动物细胞培养物的过程特征

本研究旨在了解CHO细胞培养中乳酸从生产到消费转变的分子机制，重点关注环境和遗传因素的影响。阐明乳酸代谢转变的挑战来自这两个因素之间复杂的相互作用，乳酸消耗表型的驱动因素仍然知之甚少。为了解决这个问题，研究人员评估了两个研究案例来辨别这些影响。第一个案例涉及在补料间歇过程中产生IgG的CHO细胞系中环境驱动的乳酸转移，但在间歇条件下不存在。第二个案例比较了两个克隆的产生IgG的细胞系，细胞系A只产生乳酸，而细胞系B转变为消耗乳酸的表型。两种细胞系在相同的培养条件下生长，以酚红为指示剂，pH维持在7.0左右。CHO细胞经历了乳酸代谢变化，要么转移到稳态积累阶段（此处称为“仅产生乳酸”），要么过渡到消耗乳酸阶段（称为“乳酸代谢转变”）（图1）。研究人员的数据表明，特定的营养状态，特别是谷氨酰胺的可用性，对这种代谢行为有很强的影响。似乎细胞对即将到来的营养剥夺的感知和反应能力在这些代谢转变中起着至关重要的作用。

2、乳酸代谢转变驱动了一个全球性的代谢重编程

图2 哺乳动物细胞培养物的代谢特性

为了分析乳酸产生期（称为P1）和乳酸稳态或消耗期（称为P2）之间的代谢差异，研究人员对这两个研究案例进行了全面的细胞外代谢物分析（图2）。外代谢组学数据用于主成分分析（PCA），以确定不同培养阶段和培养操作模式（案例I）以及细胞系（案例II）之间的代谢差异（图2A）。

前两个主成分（PC1和PC2）分数的散点图显示，细胞经历乳酸代谢转变的培养阶段之间的数据分布存在明显差异。在这两个研究案例中，PC1预测了培养阶段之间的差异，葡萄糖、乳酸、丙氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺是对样品总方差影响最大的代谢物（图2A）。与此同时，PC2在第一个研究案例中随培养方式的不同而略有变化。通过对整个培养过程中代谢物谱和特定消耗/生产速率（qS）的分析，这些培养阶段（P1和P2）之间的差异更为明显（图2B）。

为了进一步分析代谢组数据并评估两种情况下培养阶段之间代谢差异（和关系）的程度，研究人员将两个数据集结合起来进行多变量相关分析。该分析旨在确定特定代谢物的消耗/生产速率与乳酸代谢之间的相关性，作为潜在的生物标志物（图2C）。该分析揭示了几种与乳酸代谢密切相关的代谢物，通过关注与乳酸箭头方向相同或180度的代谢物，可以在箭头方向上观察到。相反，与乳酸箭头垂直（~ 90度）的代谢物与培养中的乳酸行为无关。从这一分析中，研究人员观察到葡萄糖代谢的代谢副产物，如山梨醇和苏糖醇，与乳酸代谢之间存在很强的相关性（图2D）。类似的相关性也发现于氨基酸如丙氨酸和天冬酰胺，以及TCA循环中间物如柠檬酸和苹果酸（图2D）。这些相关性揭示了培养过程中碳代谢和乳酸代谢变化之间的复杂联系。

3、乳酸代谢可以通过谷氨酰胺的有效性来调节

图3 通过改变培养中谷氨酰胺利用率对CHO细胞的比较分析

接下来，研究人员评估了谷氨酰胺是否作为一个杠杆来改变培养性能和细胞代谢。研究人员描述了三种不同的培养条件：低谷氨酰胺（2 mM），高谷氨酰胺（32 mM）和无谷氨酰胺（用8 mM L -乳酸盐代替）。使用案例1的产IgG细胞系在批量培养中对这些条件进行了评估，唯一的修改是在培养开始时修改/替换谷氨酰胺。使用批培养的基本原理是为了避免在分批补料培养（fed-batch）系统中富集饲料的复杂性，其中对单一变量（如谷氨酰胺）的影响无法明确评估。总的来说，研究人员的研究结果强调了谷氨酰胺在确定培养细胞性能方面的关键作用（图3）。

4、乳酸消耗表型与氨基酸（饥饿）反应的差异基因表达相关

图4 哺乳动物细胞培养的转录组分析

图5 哺乳动物细胞培养中ATF4通路的时间课程基因及蛋白表达特征

为了更深入地了解驱动CHO细胞培养中乳酸代谢转变的分子机制，研究人员对两个研究案例进行了全面的转录组分析（图4）。对于案例1，在第3,4,5和6天从饲料批次培养中分离RNA样本，每个样本平均产生5200万个reads，其中约89%的转录本被绘制出来。差异表达分析发现，在第4天至第3天，683个基因差异表达（159个下调，524个上调），第6天至第5天，1186个基因差异表达（240个下调，946个上调），分别对应于乳酸产生期和乳酸消耗期（图4A）。对于案例II，当细胞达到乳酸稳态（CL1）或转移到乳酸消耗（CL2）时，第4天的RNA样本平均产生4900万reads，其中约88%的转录本在两种细胞系中都有定位。CL2和CL1之间的差异表达分析显示，776个基因差异表达（290个下调，468个上调），反映了不同的乳酸处理表型。在充分了解案例研究中分子描述符之间的区别的同时，对共同表达谱的评估将提供与乳酸代谢平衡改变相关的分子状态的初步询问。相比之下，下调的基因与关键的生物过程相关，包括细胞凋亡信号通路和营养饥饿反应（对葡萄糖和氨基酸），这可能为可能导致代谢变化的调控提供见解，这些代谢变化有助于或与乳酸代谢转变相关。对乳酸消耗阶段常见下调基因的详细分析显示，与氨基酸（饥饿）反应（AAR）相关的基因显著下调，特别是与ATF4信号通路相关的基因（表1）。对ATF4信号通路基因表达动力学的进一步研究揭示了可能为培养物相变过程中发生的代谢重编程提供机制解释的模式（图5A）。

5、乳酸代谢可由ATF4调控

为了了解ATF4表达、培养性能和乳酸/谷氨酰胺代谢之间的机制关系，研究人员在CHO细胞中对两种研究案例进行了ATF4过表达和敲低实验（图6A）。研究人员使用PIgGybac转座子系统生成稳定的过表达ATF4细胞系，而使用由U6启动子驱动的双shRNA表达载体创建稳定的敲低细胞系。在这两种情况下，用模拟质粒构建对照细胞系。研究人员选择了ATF4表达显著升高和降低的细胞系（图6B），并根据培养性能和代谢谱对其进行了表征。在细胞代谢方面，ATF4过表达不影响糖代谢，但显著增加了两种情况下的谷氨酰胺消耗（图6I至L）。在细胞中，ATF4的过表达诱导了乳酸消耗表型，而细胞最初并未出现乳酸转移（图6M和N）。这些结果与研究表明ATF4过表达通过上调参与谷氨酰胺运输和代谢的基因表达来增强谷氨酰胺摄取的结果一致。研究人员的早期结果表明，降低培养基中的谷氨酰胺浓度或用乳酸盐替代会显著提高产物滴度，进一步支持ATF4在调节代谢反应和培养性能方面的作用。这些发现强调了ATF4作为乳酸和谷氨酰胺代谢的关键调节因子，影响CHO细胞培养中的细胞生长和生产力。

结论

本研究证实了ATF4通路在乳酸代谢和命运中的调节作用。然而，在谷氨酰胺耗竭（作为一个关键的环境因素）、ATF4激活和随后的乳酸代谢转变之间建立直接因果关系方面存在局限性。尽管广泛的代谢测量和ATF4基因调节实验支持研究人员的结论，但缺乏同位素标记通量分析限制了乳酸转移中碳流动动力学的精确结论。考虑到生物加工条件下多种营养物质的同时消耗，分离谷氨酰胺作为主要环境决定因素的影响也具有挑战性。虽然研究人员包括了谷氨酰胺浓度变化的实验，但探索其他关键营养物质（如葡萄糖、天冬酰胺和丝氨酸）的额外研究，以及13C标记的同位素分析将提供更全面、更全面的理解营养物质消耗下乳酸调节的方法。全面的代谢研究还应包括细胞内代谢组学，以监测氧化还原状态和线粒体功能的波动，这对LDH反应的平衡至关重要。最后，ATF4的环境依赖行为，最初上调，随后下调，表明一个复杂的调节作用，需要进一步的研究，包括使用蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。

另一个重要的考虑是，本研究特别关注CHODG44和CHOK1细胞系，这些细胞系需要补充谷氨酰胺来支持生长和维持活力。在其他CHO系统中，ATF4通路在调节乳酸代谢中的作用可能有所不同，代谢物（谷氨酰胺除外）可能作为细胞能量状态的主要指标，影响乳酸和其他代谢物代谢的关键触发因素。例如，使用谷氨酰胺合成酶（GS）选择系统的GS敲除（GS KO）CHO细胞，由于内源性谷氨酰胺合成，可以在无谷氨酰胺的培养基中生长。ATF4在GS KO CHO细胞和其他具有不同代谢特征的CHO细胞系统中的作用有待进一步研究。这可能揭示了ATF4调节的不同调控途径和更广泛的含义。

原文：Torres, M., Hawke, E., Hoare, R., Scholey, R., Pybus, L. P., Young, A., Hayes, A., & Dickson, A. J. (2024). Deciphering molecular drivers of lactate metabolic shift in mammalian cell cultures. Metabolic engineering, S1096-7176(24)00164-2. Advance online publication. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2024.12.001