巧妙的DNA折叠技术：打造能捉住病毒的纳米机器人

随着微纳米技术和纳米技术的进步，机器设计和制造已扩展到微纳米尺度，从而具备更多移动性和功能。纳米机器人能够利用外部能量模拟自然复合物的运动，展现出在医学领域的巨大应用潜力。DNA作为遗传信息载体，通常以双螺旋结构存在，其特性使其成为构建精确尺寸和曲率纳米级物体的理想材料。近年来，DNA折纸技术在设计和制造纳米级结构方面表现出色，能够创建如柔顺结构、可控纳米马达等多种结构。抓取能力是纳米机器人的一项重要功能，但之前的研究尚未实现由单个折纸片组成的抓手机制。新研究表明，DNA纳米结构可以与适体和抗体结合，以检测或抑制病毒感染，包括针对登革热和SARS-CoV-2的设计。尽管已有先进设计，但仍需进一步发展能够像人类手指一样抓取纳米级物体的机制。

美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校团队开发出了一种创新的工具--由单一DNA分子折叠成的四指微型“手”，其被命名为DNA NanoGripper（DNA NG或简称NG），其设计灵感来源于鸟爪、人手和噬菌体。该机器人由一个单一的折纸片构成，包含四个可弯曲的手指，每个手指通过三个旋转关节实现自适应能力。图1展示了NG的设计原理、功能化方法及其在病毒检测和抑制中的应用。NG的每个手指由三个指骨和三个可旋转的关节连接，整体设计复杂，包含12个关节和13个部件，通过精确的支架和钉线路线组装成一个完整的DNA折纸片，从而控制手指的弯曲方向。NG的功能通过附着在手指表面的配体与其结合伙伴之间的相互作用驱动。此外，NG的手指经过功能化，可以携带多个荧光团标记的DNA适体纳米开关，这些纳米开关被编程为选择性识别SARS-CoV-2病毒。当与病毒结合后，纳米开关释放荧光信号，并在与光子晶体（PC）表面的互补序列杂交后增强该信号。此外，流式细胞术和共聚焦显微镜成像结果显示，NG-适体复合物能够有效阻止病毒进入宿主细胞，展现出作为病毒抑制剂的潜力。

图1 DNA NG设计、功能化及其在病毒检测和抑制中的应用示意图。(A) DNA NG的结构和尺寸，包含一个中央手掌和四个可弯曲的手指，其中F， Z和R分别代表手指，旋转轴和旋转关节。(B) DNA NG与三维纳米物体相互作用的功能化，包括auNP（~50和100 nm）、auNUP （~80 nm）和SaRS-coV-2 （~100 nm）。“d”表示直径。(C) DNA NG检测SaRS-coV-2及细胞进入抑制示意图。

研究人员对NG的雕刻、合成和表征进行了系统研究。在第一步的纳米机器合成中，设计四指结构时考虑了三个关键因素：人类和大多数鸟类通常有三至五个手指；三指结构在一根手指失效时会影响抓取能力；现有的DNA支架不足以支持五指设计。在纳米机器尺寸合成阶段，研究人员的目标是使NG能够轻松抓取直径为50至100纳米的物体。

在设计分析与优化阶段，研究人员依据支架DNA的长度（8064个碱基）确保NG保持开放构型。每个手指通过结合4至6个核苷酸长的单链DNA（ssDNA）铰链实现灵活性。进一步地，研究人员利用MagicDNA、oxView和caDNAno等工具完成整个NG设计和支架路线，并在手掌与手指之间添加dsDNA链接，以约束手指的可弯曲性，确保其保持开放状态。此外，为实现可编程功能，研究人员在四个手指的内向表面装饰了52个ssDNA悬垂，以便与互补的ssDNA或适体杂交，从而实现对纳米级目标的捕获。

图2 DNA NG设计。(A)确定手指和手掌的最佳横截面尺寸。(B)最受欢迎的手指-手掌连接设计示意图，该设计提供手指向外翻转以确保NG手指在自由溶液中保持开放构型(i)，以及使用MagicDNa （ii）和oxView （iii）显示的支架DNa布线示意图。

NG结构由长达8064个核苷酸的“支架”DNA和229条“短钉”链组成。在含有镁离子（Mg²+）的1×三乙酸-乙二胺四乙酸（TAE）缓冲液中，以摩尔比1:10的支架与短钉进行高低温热退火以形成NG。研究人员筛选了不同Mg²+浓度（12~22 mM）的缓冲液，以确定NG的最佳形成条件，结果显示在所有含Mg²+的缓冲液中，NG都占优势。然而，当Mg²+浓度超过16 mM时，NG开始形成无法在凝胶中移动的高分子量聚集体。因此，选择了含16 mM Mg²⁺的1ÍTAE缓冲液来制备NG组件，以避免聚集现象。在后续的表征和分析之前，所有新鲜制备的NG样品通过Bio-Rad Freeze 'N'挤压DNA凝胶萃取柱或聚乙二醇（PEG）沉淀进行纯化，以去除多余的短链。经过琼脂糖凝胶电泳分析，纯化后的NG样品未检测到游离短钉。研究人员利用原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）对NG结构进行可视化，展示了其包含四个可弯曲手指的不同姿势。此外，还收集了速冻NG样品的低温电子显微镜图像，以显示其在三维空间中的各种姿势。结果表明，在液体中，所有手指均从手掌中央向外伸展，显示出捕获纳米级物体的潜力。

图3 DNA NG的合成与表征。(A) DNA NG程序热退火组装示意图。(B)在不同Mg²⁺浓度的缓冲液中，aGe显示NG的形成（作为一个优势带）。在随后的表征和分析之前，所有NG样品都被纯化以去除多余的短纤维链。(C) DNA NG样品显微图像。(i)原子力显微镜图像。（ii）阴性染色后的TEM图像。（iii）低温电镜图像。(D) TEM成像获得的DNA NG结构与相应的NG三维模型构型的并排比较。比例尺表示100 nm。

研究人员通过装饰NG的手指与单链DNA（ssDNA）或针对SARS-CoV-2表面刺突蛋白的DNA适体，展示了NG捕获3D纳米级物体的潜力。AFM和TEM图像显示，NG能够捕获与其手指上ssDNA链互补的ssDNA序列包被的球形金纳米颗粒（AuNPs），直径为50或100纳米。研究人员使用琼脂糖凝胶电泳（AGE）定量不同混合比例的NG-AuNP复合体，结果表明，当NG数量远超AuNP时，形成了不同分子量的复合物。随着AuNP数量的增加，更多较小和较大的分子量复合物得以形成，AGE分析显示不同迁移率的红色凝胶种。研究还发现，当NG的手指上装饰混乱的ssDNA时，NG无法有效捕获AuNP。为了增强功能性，研究人员在NG上附着了针对SARS-CoV-2刺突蛋白的适配体，使其能够通过多价相互作用捕获病毒粒子。研究人员利用酶联免疫吸附试验（ELISA）和冷冻电子显微镜成像验证了病毒粒子表面的刺突蛋白仍然保持完整。AGE分析确认适配体成功结合到NG支架中，AFM图像显示所有NG-适配体复合物保持开放构型，确保与病毒表面刺突有效相互作用。由于刺突蛋白在SARS-CoV-2表面的分布不均匀，多个NG可以以不同姿势附着在病毒表面。冷冻电镜图像进一步显示，纳米颗粒能够有效结合直径约170纳米的SARS-CoV-2病毒，强调了其在结合不同尺寸颗粒方面的通用性。为深入了解NG适配体与SARS-CoV-2之间的相互作用，研究人员还进行了低温电子显微镜断层扫描分析，以获取复合物的3D视角。作为阴性对照，混乱适配体未能捕获SARS-CoV-2，从而证实了所用适配体的特异性。这些发现为利用NG检测和抑制病毒感染奠定了基础。

图4 DNA NG捕获AuNPs和SARS-CoV-2。(A) AFM和TEM图像显示auNPs与携带ssDNa的DNa NG相互作用，其序列与覆盖在auNPs上的ssDNa互补（50或100 nm）。白色和蓝色箭头分别表示NG（指）和auNP。比例尺表示50 nm。(B)低温电镜图像显示携带多个刺突蛋白靶向适配体的DNA NG捕获SaRS-coV-2。红色箭头表示右指。比例尺表示50 nm。

研究人员展示了NG在自由溶解环境中捕获各种大小球形实体的能力，包括通过DNA杂交捕获AuNPs和通过适体-蛋白质相互作用捕获SARS-CoV-2病毒。在此基础上，研究人员深入探讨了NG与其靶标之间的相互作用，关键评估NG在单分子检测中的数字分辨率与直接计数能力。为此，研究人员以金纳米尿囊素（AuNUP）为目标，采用光子谐振腔吸收显微镜（PRAM）成像作为读出检测方法。这一方法旨在将对NG能力的理解从自由溶液环境扩展到表面锚定场景，从而扩大其在敏感分子检测中的潜在应用范围。研究人员在NG的手掌底部添加了五个ssDNA悬垂，称为“锚点”，以便与涂覆在光子晶体（PC）生物传感器表面的互补“捕获”ssDNA杂交，进行表面捕获和成像。NG通过手指表面携带的生物素化ssDNA功能化，能够捕获链霉亲和素包被的AuNUP，并将NG-AuNUP复合物带到PC表面进行成像。为了展示剂量反应，研究人员使用PRAM观察和计数不同浓度下PC表面NG捕获的AuNUP。PRAM被开发用于成像附着在PC表面的金属纳米颗粒，使得纳米颗粒的检测小于衍射极限。结果显示，在不同浓度的溶液中，通过锚定捕获DNA杂交将NG捕获的AuNUPs带到PC表面后，随着孵育时间的延长，NG捕获的AuNUP数量增加。此外，当使用单体生物素化的ssDNA作为阴性对照探针时，由于非特异性结合，观察到的信号较少。

图5 DNA NG在PC表面捕获和计数aunp。(A) ng捕获的aunup的捕获和计数示意图。在放大的子面板中，NG可以捕获AuNUPs，然后通过手掌上的“锚定”ssDNA（红色箭头表示）和PC表面的互补表面“捕获”DNA（白色箭头表示）的杂交将其带到表面。NG通过生物素-链亲和素结合与AuNUPs相互作用。使用SEM和TEM成像对AuNUP的大小和形状进行了表征（图S26）。(B)在不同颗粒浓度和不同孵育时间点测试的DNA NG表面捕获的AuNUPs（黑点）的PRAM图像。游离生物素化的ssDNA（未附着于NG）作为阴性对照探针，显示PRAM扫描PC表面的背景。(C)在表面固定NG存在或不存在的情况下PC表面的透射扫描。(D)在不同浓度和不同孵育时间点测试的DNA NG表面捕获的AuNUPs计数。

研究人员在证明NG能够捕获溶液中的结合靶标并通过数字计数将其带到光子晶体（PC）表面进行定量后，重新设计了NG，使其成为一种高度敏感的病毒生物传感器。具体而言，他们在NG的手指表面附着了针对SARS-CoV-2的适配体纳米开关。如图6A所示，每个纳米开关被编程为包含荧光FAM标记的适体，该适体与猝灭剂BHQ标记的“锁定”DNA寡核苷酸部分杂交，从而在没有SARS-CoV-2存在时有效地猝灭荧光。

功能性NG只有在捕获SARS-CoV-2颗粒时才能释放荧光信号，因为当适配体与刺突蛋白结合时，猝灭寡核苷酸会被踢出。通过设计多个适配体锁对，这种适配体与刺突蛋白的结合通过多价相互作用得到进一步增强，从而产生强大可靠的荧光信号。随后，研究人员使用PC增强荧光（PCEF）技术对释放的荧光进行增强，该技术提供了高信噪比，适用于超灵敏的SARS-CoV-2检测。

在NG-PC混合系统中，PC增强了集中在锚定NG中的未锁定报告基因的荧光，研究结果显示，与玻璃基板上的NG报告基因相比，信号强度增强了近250倍。研究还发现，由于高浓度的NG，传感器在溶液中捕获SARS-CoV-2的速度很快。捕获病毒后，通过NG手掌底部的锚定ssDNA与涂覆在PC表面的捕获ssDNA杂交，将NG病毒复合物沉积并锚定在功能化的PC表面，从而激活并增强荧光信号。

最终，该策略几乎没有脱靶信号，使得检测限达到100拷贝/ml，与FDA批准的RT-qPCR检测灵敏度相当。此外，研究人员使用HIV和HBV作为阴性对照进行特异性测试，结果表明为SARS-CoV-2设计的NG适配体传感器即使在高病毒载量下也未与这些阴性对照病毒交叉反应。

图6 基于DNA NG传感器的PC增强SARS-CoV-2检测(A)病毒捕获和荧光信号产生机制示意图。(B) NG-PC杂交系统示意图显示，NG适体可以在自由溶液中捕获SaRS-coV-2，然后通过锚定（锚定在NGs上）和系链DNA（锚定在PC上）杂交将其带到PC表面。(C)实验获得的PC近场增强和PCEF扫描显微镜与玻璃基板上的NG报告器相比，信号增强近250倍。(D) PC增强数字计数及SaRS-coV-2检测的剂量响应。在不同病毒浓度（102 - 107拷贝/ml）下，与NG传感器孵育10分钟后捕获的SaRS-coV-2的PC表面的代表性扫描图像。比例尺，50µm。(E)不同病毒浓度下Pc表面捕获的SaRS-coV-2病毒粒子的定量。红色曲线是连接代表不同病毒浓度下荧光信号计数平均值的点的结果。

研究表明， NG能够通过物理阻断SARS-CoV-2病毒与宿主细胞的相互作用，从而防止病毒进入细胞。冷冻电镜成像分析显示，多个DNA NG可以结合到SARS-CoV-2的表面，因此研究人员假设DNA NG可以在病毒颗粒与宿主细胞之间形成物理屏障，从而潜在地抑制病毒感染。

为了验证这一假设，研究人员使用流式细胞术分析了在不同复杂成分和浓度下，存在或不存在DNA NG时对Vero E6细胞中SARS-CoV-2感染的影响。首先，对活的单细胞事件进行门控，然后使用针对SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD）的单克隆抗体检测MHCI阳性群体的病毒载量。结果显示，与携带52个刺靶适体的4 nM DNA NG孵育的病毒相比，宿主细胞上和细胞内的病毒载量显著减少。

定量分析表明，含有靶向刺突适体的4 nM DNA NG可将病毒载量降低约99%，而0.4 nM的相同NG适体则具有约70%的抗病毒功效。相比之下，标准化浓度的游离适体未能表现出相应的抗病毒效果。此外，与DNA NG或携带混乱核酸适配体的NG孵育的病毒未能降低宿主细胞中的病毒载量，这表明虽然DNA NG提供了夹持功能，但识别SARS-CoV-2所需的分子相互作用来自于刺突特异性结合适配体。

图7 流式细胞术检测结果表明，DNA NG -适配体复合物能够非常有效地阻断病毒与细胞的相互作用和病毒的进入。(A)流式细胞术对比分析浓度匹配的游离适配体和DNA NG -适配体复合物介导的病毒抑制显示出高度有效的预防病毒进入细胞。(B)使用FITC偶联单抗对SaRS-coV-2刺突RbD进行细胞内染色，定量检测病毒进入细胞，进一步证实了DNA NG适体构建物的抗病毒效果。

共聚焦成像技术显示，SARS-CoV-2病毒粒子在与靶向刺突蛋白的适配体功能化的NG结合后，失去了细胞内化能力。同时，未附着在NG上的相同单体适配体无法有效阻止病毒进入细胞。具体而言，在共聚焦实验中，研究者对Vero E6细胞膜进行了DiD染色（显示为黄色），并使用赫斯特染色对细胞核进行标记（显示为蓝色）。SARS-CoV-2病毒粒子则用FAM荧光团标记的适体进行标记，以便在共聚焦显微镜下可视化。在实验中，研究人员将仅结合游离适配体或DNA NG-适配体结合的SARS-CoV-2病毒粒子引入染色细胞，以进行后续的病毒进入分析。随后，他们开发并实施了收集的共聚焦图像的3D重建，以提供基于可视化的定性分析，并比较病毒粒子进入DNA NG-适配体复合物与单体适配体对照之间的差异。

图8 DNA NG抑制SARS-CoV-2病毒进入细胞用FaM、Dil和hoescht染色分别标记SaRS-coV-2病毒粒子（红点）、Veroe6细胞膜结构（黄色）和细胞核（蓝色）。代表性的SaRS-coV-2病毒颗粒用白色箭头表示。(A)在单体适体存在的情况下，SaRS-coV-2病毒粒子随时间在细胞中积累。利用一种靶向SaRS-coV-2的FaM荧光团标记适配体作为片段标记病毒颗粒进行荧光成像；它还作为仅适配体对照，提供基于可视化的定性分析，并将其抗病毒功能与基于DNA NG适配体的病毒抑制剂进行比较。(B) DNA NG处理可抑制SaRS-coV-2病毒的进入。每个面板都伴随着主视图的三个横截面（沿着主图像中的虚线）。共聚焦图像显示，游离的核酸适配体结合的SaRS-coV-2颗粒在细胞中积累(a)，而DNa ng -核酸适配体结合的SaRS-coV-2颗粒在很大程度上被阻止进入细胞(b)。

该研究展示了设计、合成和表征复杂DNA NG纳米机器的方法，且开发的DNA NG在纳米尺度上展现出良好的生物相容性、可编程的机械性能和精确的结构寻址能力，能够有效捕获金纳米粒子、金NanoUrchins和SARS-CoV-2病毒粒子，并作为高灵敏度的生物传感器，检测人唾液中的完整SARS-CoV-2病毒，检测限为每毫升100拷贝，与逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）灵敏度相当，并能有效阻止病毒进入宿主细胞，显示出其抑制病毒感染的潜力，为病毒检测和潜在抑制提供了创新的解决方案。

论文链接：https://doi.org/10.1126/scirobotics.adi2084