准确检测疾病生物标志物是健康管理的基础。随着即时检测技术（POCT）的快速发展，患者可以在家中或非医院环境中进行临床分析。然而，传统POCT面临准确性与检测速度之间的权衡，导致只有少数设备成功转化为临床应用。为提高现场测试的准确性，研究者们开始应用生物统计学、差分读出和机器学习等新技术。现有的POCT通常依赖单一信号源进行诊断，这种方法容易受到多种因素的影响，导致传感误差。因此，迫切需要开发一个综合平台，以降低复杂现场环境中不准确性的发生。

基于此，复旦大学分子材料与器件实验室的研究者提出了一种双模式多分类诊断平台（称为DMDP，图1），该平台基于结合电化学发光（ECL）和场效应晶体管（FET）传感单元的微流控芯片。ECL传感器通过单电极表面将电子转换为光，而FET传感器则监测受外部扰动影响的漏源电流。DMDP芯片引导测试样品沿微流控通道流动，顺序产生双模读数，这些数据用了集成微流控芯片进行双模信号采集，化学稳定的生物探针进行特异性识别，ML算法进行高效数据集成，多标签分类器用于临床决策（图1a）。由于不同的信号转导过程，组合式ECL和FET传感器在实际测试中没有干扰。此外，所提出的机器学习模型不同于传统的降维算法，后者在高维空间中学习临床感知数据的固有特征。因此，基于两种传感机制的双模信号转导在物理上减少了误导性读数，而ml辅助的多分类模型能够在数学上最大限度地减少偶尔的不准确。

图1 双模多分类诊断平台（DMDP）概述。a)使用该平台的诊断程序示意图。框P、N和N/A分别表示正类、负类和未分类。b) DMDP芯片配置。(1)用户通过添加孔输入一滴分析样品。(2)用工装孔固定传感器芯片的每一层。(3)用于引导样品流动的微流控通道。(4)通过固定在传感区域（红色虚线框）上的生物探针捕获目标分析物，该传感区域连接到分析仪进行双模式读数。(5)出液孔用于排出过量溶液。右面板：照片的DMDP芯片与硬币的规模。c)不同传感区域的结合过程示意图。宿主探针结合到目标分析物的电化学发光（ECL）和场效应晶体管（FET）读出。注：RE，参比电极。WE，工作电极。CE，对电极。G,门。D,排水。

研究人员将电化学发光（ECL）和场效应晶体管（FET）传感单元集成在3D打印的微流控芯片中，以顺序生成光学和电子读数。该芯片由四层组成，包括底层、聚酰亚胺（PI）膜、200 μm厚的微流控带和顶层，顶层和底层均由聚碳酸酯制成。传感区域由ECL传感单元和FET传感单元构成，ECL单元包含工作电极、对电极和参比电极，而FET单元则包含栅极、源极、漏极和石墨烯通道。在测量之前，研究团队逐层组装DMDP芯片，并向芯片中加入样品。通过抗体和DNA适体选择性识别靶标，生物探针通过金纳米颗粒固定在工作电极和栅极上。这种协同识别过程在不同传感区域产生电子和光学读数，提高了POCT应用中的可重复性。DMDP芯片在多变量测试环境下表现出较小的相对标准偏差（低于3.1%）。

为了验证生物探针的附着性，研究人员使用原子力显微镜（AFM）对电极表面进行了表征，发现生物探针随机分布，平均高度约为10 nm（抗体）和6 nm（DNA探针）。此外，通过X射线光电子能谱（XPS）分析确定了功能化探针的化学成分。电化学阻抗谱进一步验证了生物探针的成功功能化。在测试性能方面，研究人员用不同探针修改传感器，并测量多种含有蛋白质和核酸的感染性生物标志物。样品加入后，分析物-探针结合事件产生光电双模信号。信号经过Z-score归一化、特征提取和机器学习分析，以生成诊断决策。对于HRV检测，ECL检测过程中的信号峰短于60秒，而FET传感器能检测到低至10−17 mol L⁻¹的HRV RNA，平均响应时间约为70秒。

图2 操作和特性的示意图。a) Ab/ aunp修饰电极表面的原子力显微镜（AFM）图像（在1× PBS缓冲液中）。b)抗体修饰表面的p2p区。A.U，任意单位。c)电极上逐步修饰过程的电化学阻抗谱图。d)说明结合位点和相互作用的蛋白-蛋白复合物。e)不同浓度的人ICAM-1重组蛋白的电化学发光（ECL）测定。UTM，通用输送介质。f)在UTM中加入10−19 mol L⁻¹和10−16 mol L⁻¹人鼻病毒（HRV） RNA后的∆Ids/ idso vs . t曲线。

为了验证DMDP在临床试验中的普遍性，研究人员收集了501份来自结核病、HRV、GBS、COVID-19、流感患者及健康受试者的合格临床样本。实验结果和实时信号数据在图S17-S21中展示。研究采用了一维（1D）、二维（2D）和DMDP三种不同维度的对照实验，以进一步评估其临床疗效。现有的一维测试通常在不添加样本的情况下使用比基础信号大三倍的截止值，而二维测试则使用截止线进行分类。然而，这些方法的基本限制使得对模糊样本的分类变得困难，导致准确性的快速下降和偶尔的误诊。相比之下，训练良好的SVM-R3D模型将原来的二分类问题转化为凸二次规划问题，以生物权重处理输入数据集，并生成三维超平面作为截断阈值。

在没有实验室技术人员帮助的情况下，DMDP显示出99%（95% CI 0.94 - 1.00）的诊断准确率，显著高于1D方法的<92%准确率和2D方法的≈95%准确率。值得注意的是，该平台在5分钟内完成整个诊断过程，并在临床多变量环境下表现出稳定的信号采集能力。在相同实验条件下，室温保存10天后，信号未出现明显退化。

图3 采用双模多分类诊断平台（DMDP）进行多分类诊断。a)使用一维（1D，左图）、二维（2D，中图）和三维（3D，右图）分类器对人鼻病毒（HRV）样本进行临床检测。A. U，任意单位。b)使用1D（左图）、2D（中图）和3D（右图）分类器对结核病（TB）样本进行临床试验。c)使用1D（左图）、2D（中图）和3D（右图）分类器对B群链球菌（GBS）样本进行临床检测。（a−c）中，0类、1类、2类分别为正、负、未分类样本组。N为总样本数，m为第2类样本数。d)诊断分类器在不同维度的性能对比。e) HRV、TB和GBS样本的诊断时间。f)测量不同生物标志物时DMDP的长期稳定性测试。

研究人员通过受试者工作特征（ROC）曲线评估了机器学习（ML）算法的性能，分析了假阳性率（FPR）与真阳性率（TPR）之间的关系。在ROC曲线中，曲线下面积（AUC）指示分类器将随机选择的阳性样本排序高于阴性样本的概率。对于筛选测试，分类器应尽量减少假阴性结果的数量。该平台在检测未处理样品时的AUC值达到99%，与参考标准方法相当。此外，研究还评估了DMDP、酶联免疫吸附测定（ELISA）和其他标准方法的综合临床准确性。根据维恩图分析，DMDP成功识别了501个临床样本中的495个，而ELISA在相同条件下误诊74个。

图4 交叉验证试验中的临床表现。a)左图：采用PCR、双模多分类诊断平台（DMDP）和酶联免疫吸附试验（ELISA）诊断人鼻病毒（HRV）的受试者工作特征（ROC）曲线。中图：干扰素释放法（IGRA）、DMDP和ELISA诊断肺结核（TB）的ROC曲线。右图：用PCR、DMDP和ELISA诊断B组链球菌（GBS）的ROC曲线。每种方法的曲线下面积（AUC）值。b)支持向量机提升三维（SVM-R3D）模型的混淆矩阵。c)用DMDP、ELISA和参考标准方法分类的临床样品。d) 501个临床样本中用于识别疾病生物标志物的选定检测技术。注：取TB-QUICK诊断结果取新一代宏基因组测序（mNGS）诊断结果取MALDI-MS诊断结果。[62]取暗场显微镜诊断结果。 e)目前实验室检测和商业试剂盒准确性的比较。

本研究成功开发了一个光电多分类诊断平台，以减少资源有限和快速POCT设置中的偶尔不准确性。该平台结合了电化学发光（ECL）和场效应晶体管（FET）传感单元，通过优化机器学习（ML）算法处理复杂疾病信息的多变量数据。在临床试验中，由于信号转导机制的差异，电信号和光学读数之间没有干扰。研究表明，DMDP在没有实验室技术人员帮助的情况下，显示出99%的诊断准确率，显著高于现有POCT方法。此外，该平台在5分钟内完成整个诊断过程，并在相同实验条件下表现出稳定的信号采集能力。DMDP的设计使其能够通过集成额外的传感单元进行高通量信号采集，进一步提高分类性能和F1分数。这种双模式多分类策略有效减少了临床干扰引起的误诊，使POCT快速诊断的准确性接近常规实验室检查，为个性化医疗保健的发展提供了支持。

论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adma.202312540