金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)可引起多种感染，从中度严重的皮肤感染到危及生命的感染，包括致命的肺炎和败血症。此外，金黄色葡萄球菌也是最重要的动物病原体之一，尤其是作为牛乳腺炎的病因。在农场，感染的传播通常发生在挤奶过程中，通过受污染的机器、设备或挤奶工人的手在奶牛之间传播。因此，金黄色葡萄球菌是一个重大且代价高昂的公共卫生问题。以快速和低成本的方式早期筛查和超灵敏检测金黄色葡萄球菌对于促进食品质量和安全非常重要。

到目前为止，传统的金黄色葡萄球菌检测方法，即酶联免疫吸附试验、色谱法、表面增强拉曼散射和环介导等温扩增被广泛使用。虽然这些方法可靠且准确，但过程需要复杂的扩增和标记程序，这使得它们耗时且昂贵。此外，对于大多数这些方法，没有可以定量测量金黄色葡萄球菌浓度的用户友好的便携式分析系统。

基于晶体管的电化学生物传感器因其能够实现高通量、超灵敏、低成本、快速、实时、无扩增和无标记的微生物检测而受到越来越多的关注。通常，这种生物传感器能够使用晶体管作为传感器，将特定传感界面上的生化/生物反应引起的生物信号转换为电信号。由于基于晶体管的生物传感器具有高效的信号转换机制，因此由于灵敏度高，可能无需额外标记。此外，晶体管固有的信号放大能力使得无需进行核酸扩增即可检测最低水平的目标。此外，这种基于晶体管的生物传感器易于集成到电子系统中，有助于整个传感系统的小型化，以适应便携式应用场景。因此，基于晶体管的电化学生物传感器是最有前途、最经济、最快速的传感平台之一。

溶液门控石墨烯晶体管(solution-gated graphene transistor, SGGT)具有出色的生物相容性、化学稳定性和较高的检测灵敏度，已被广泛用于开发用于检测微生物的基于晶体管的生物传感器。大多数SGGT生物传感器的研究都是通过将特异性探针直接固定在单层石墨烯通道上来最大化其灵敏度。然而，将生物分子探针组装到石墨烯上涉及多个功能化步骤，难以实现。此外，测试环境中的其他干扰也会导致单层石墨烯通道上的非特异性吸附，从而降低其选择性。因此，人们开发了一种替代的SGGT生物传感器，采用功能化栅极作为敏感栅极，同时保持器件的高效传感能力。由于成熟的HS-Au化学性质，金电极作为固定各种HS锚定探针的基底，已广泛应用于SGGT DNA传感器。为了检测目标ssDNA序列，根据沃森-克里克碱基配对定律，使用互补ssDNA专门设计了一种探针，以最大程度地提高其杂交效率。最近的研究表明，探针在金上的形成也对其杂交效率有很大影响，导致灵敏度下降或检测速度的问题。尽管已经使用多种SGGT来检测微生物中的ssDNA序列，但它们仅限于器件概念的验证。探针序列对其传感性能的影响机制仍然不太清楚。由于探针/目标在金栅极表面的杂交效率低下，导致灵敏度低或检测耗时，这阻碍了在便携式系统中实现对金黄色葡萄球菌的快速无扩增检测。

近日，上海交通大学电子信息与电气工程学院唐伟团队在Chemical Engineering Journal期刊上发表了题为：Amplification-free and label-free rapid detection of Staphylococcus aureus using solution-gated graphene transistor-based DNA biosensor with hybridization enhancement by interface engineering论文。

为解决上述问题，本研究开发了一种无标记、无扩增的SGGT DNA生物传感器，该传感器具有高灵敏度的界面工程传感门，可定量检测金黄色葡萄球菌。金传感门表面固定有硫醇（thiol, HS）修饰的特定互补ssDNA探针和阻挡层，分别以捕获目标序列和抑制非特异性吸附。进一步研究了ssDNA探针修饰电极的界面工程对探针/靶杂交效率的影响。这使得探针的核苷酸组成得到优化。因此，优化的ssDNA探针能够有效地与金黄色葡萄球菌ssDNA分子靶杂交，导致SGGT生物传感器的狄拉克电压点发生较大偏移。该生物传感器的线性检测范围为10^-17 M至10^-8 M，检测限（limit of detection, LoD）为10^-17 M。整个检测在27 min内完成，无需任何核酸扩增或化学或生物标记过程。此外，该生物传感器可以特异性地将目标金黄色葡萄球菌ssDNA与完全碱基错配ssDNA（full base mismatch ssDNA, All-Mis）、9碱基错配ssDNA（9-base mismatch ssDNA, 9-Mis）和3碱基错配ssDNA（3-base mismatch ssDNA, 3-Mis）区分开来。除了对金黄色葡萄球菌ssDNA序列的出色区分外，该生物传感器还对金黄色葡萄球菌和其他细菌表现出良好的选择性。利用新开发的生物传感器，在便携式智能传感系统中成功实现了对金黄色葡萄球菌基因组（ATCC6538）的实时现场检测。此次成功实施验证了该生物传感器在快速、便捷检测金黄色葡萄球菌的潜在实用性和适用性。

图1显示了使用SGGT生物传感器对金黄色葡萄球菌DNA进行无标记和无扩增检测的示意图，该传感器的传感门功能化了特定的ssDNA探针。如图1(a)所示，所提出的SGGT生物传感器有可能以无标记和无扩增的方式直接检测从受污染的乳制品中获得的金黄色葡萄球菌DNA。该生物传感器将生物信号转换为电信号，可以通过便携式仪表系统轻松读取和记录。传感过程涉及目标与传感门的特定结合。这种相互作用导致浓度依赖性的界面电位变化，从而输出可以测量和分析的相应通道电流。信号转导还依赖于高质量的半导体通道，该通道是通过转移通过化学气相沉积生长的石墨烯获得的。

图1（b）描述了金传感门功能化方案及其识别过程。为了选择特定的检测靶标，从GenBank下载了编码金黄色葡萄球菌热稳定核酸酶的nuc基因的多个序列，并使用BioEdit软件和BLAST工具进行比较。选择金黄色葡萄球菌内保守的跨物种序列作为特异性靶标。设计互补的ssDNA链作为特异性探针，以选择性捕获目标序列。硫醇化ssDNA探针通过金-硫键固定在栅极上，而MCH用作阻挡层，以减少ssDNA与金的相互作用，从而提高杂交识别的特异性。图1（c）显示了栅极电极/电解质界面附近电双层(electrical double layer, EDL)中的电位分布，该电位分布可能受传感栅极电极表面发生的各种生化事件的调节。当目标金黄色葡萄球菌ssDNA分子与探针ssDNA结合时，由于目标金黄色葡萄球菌ssDNA分子的电负性，电位降低。图1（d）描绘了在栅极/电解质和电解质/通道界面之间形成的两个EDL的简化等效电路模型。由于探针ssDNA和目标ssDNA的电负性，当探针ssDNA固定在栅极电极上时，栅极电极的电位从V_GS变为V_GS'；而当目标ssDNA被探针ssDNA捕获后，栅极电极的电位从V_GS'变为V_GS''，导致狄拉克电压点移动一个电压偏移量（V_offset），如图1（e）所示。这样，狄拉克电压点可以根据捕获目标的浓度相应移动，从而触发生物传感器对目标分子的响应。

图1 （a）使用SGGTDNA生物传感器进行无标记、无扩增检测金黄色葡萄球菌基因片段的示意图。（b）金传感门的功能化示意图，其中ssDNA探针用于特异性捕获目标ssDNA，6-巯基-1-己醇(6-mercapto-1-hexanol, MCH)阻断剂用于禁止干扰物的非特异性吸收。（c）传感门/电解质界面处形成的电双层附近的电位分布。（d）金黄色葡萄球菌ssDNA目标与探针杂交之前和之后整个设备的电位分布示意图。（e）传感门捕获后生物传感器的转移曲线对目标金黄色葡萄球菌ssDNA的响应。

接下来进行了探针的固定和电化学表征。对有/无ssDNA修饰的传感栅极电极进行了静态水接触角(contact angle, CA)测量，以确认传感表面的功能性。如图2（a）所示，在ssDNA探针通过Au-S键共价连接到传感栅极后，ssDNA上的磷酸基团导致表面亲水性增加。CA从89°降低到52°，表明探针已有效固定在传感栅极上。图2（b）给出了基于SGGT的金黄色葡萄球菌传感器在传感栅极上固定ssDNA探针之前和之后的传递特性曲线。带负电荷的ssDNA锚定后，传感器的狄拉克电压点移动了66 mV，表明设计的传感栅极对DNA序列的吸附具有有效的界面电位响应。

为了进一步证实潜在的电化学过程，使用含有Fe(CN)₆^3-/Fe(CN)₆^4-的磷酸盐缓冲溶液对传感电极进行常规电化学阻抗谱（electrochemical impedance spectroscopy, EIS）和循环伏安法（cyclic voltammetry, CV）测试。图2（c）给出了裸传感栅极（Au）及其被探针（ssDNA/Au）修饰后的奈奎斯特图，插图为简化的等效电路图。可以看出，纯金由于电导率高，曲线几乎为直线，说明电极表面电子转移效率高；当ssDNA固定在金电极上时，半圆曲线的直径变大。这意味着电子向电极表面的转移阻力增大，这是由于带负电荷的REDOX对被ssDNA带负电荷的磷酸骨架排斥所致。此外，图2（d）表明，在ssDNA修饰前后，CV曲线中的一对REDOX峰及其对应的峰电位分离发生了明显变化。金的CV曲线具有明显的REDOX峰，但在ssDNA修饰后峰变小，证实金电极的电化学活性下降。因此，基于物理和电化学表征，证明了HS修饰的ssDNA探针在金传感栅极上的固定化是有效的，这为它与各种ssDNA探针的接口工程提供了一种简单的方法。这种方法可以优化和定制传感界面，最大限度地提高其检测能力。

图2 (a）ssDNA探针改性前后金传感栅极的水CA。（b）金黄色葡萄球菌ssDNA SGGT生物传感器在传感栅极电极上改性前后的转移曲线。（c）裸露和ssDNA改性栅极电极的EIS曲线。插图：等效电路图。（d）扫描速率为50 mV⋅s^-1时裸露和ssDNA改性栅极电极的循环伏安法(CV)曲线。

研究人员接下来研究了传感门接口工程与探针优化。传感性能由特定ssDNA探针与金黄色葡萄球菌基因相应片段的杂交效率决定。这在很大程度上取决于ssDNA探针的有序直立构象。因此，获得所提出的SGGT DNA传感器高灵敏度的关键是通过探针优化对ssDNA修饰传感门进行界面工程来提高杂交效率。研究表明，DNA核苷酸对多晶金的亲和力遵循以下顺序：腺嘌呤(A)>胞嘧啶(C)≥鸟嘌呤(G)>胸腺嘧啶(T)。由于ssDNA探针的空间排列强烈依赖于碱基，因此必须优化探针链及其相应的目标金黄色葡萄球菌DNA序列。为了验证这一假设，利用三段金黄色葡萄球菌DNA序列目标片段来评估所构建的SGGT的性能，该SGGT由各种界面工程传感门与特异性探针组成，如图3(a)所示。探针I由12个A碱基组成。而探针II由较少的A碱基组成，因此，相应的特异性探针（探针I和探针II）被设计为与由各种T碱基组成的目标序列互补。与探针II相比，探针III被专门设计为具有包含更多T碱基的接头。

如图3（b）所示，当将不同浓度的靶标添加到测试孔中时，与预期一致，SGGT传感器与探针-I结合产生的狄拉克电压点的偏移非常小。这是因为低聚物（oligomers, dA）和金之间的相互作用非常强，以至于溶液中的dA/dT双链特别容易变性，从而阻止了探针/靶标DNA链杂交。因此，探针-I中多聚腺嘌呤碱基的比例较大，导致探针的ssDNA链与金电极相互作用，阻碍了与靶标ssDNA的杂交。对于具有较少T碱基的Target-II，探针-II中的探针序列由较少的A碱基组成，预计它会将其主链直立延伸到溶液中，以促进与靶标序列的有利杂交。图3(c)显示，与探针-I相比，带有探针-II的SGGT传感器对不同浓度的目标ssDNA的响应有所改善。这表明探针序列对杂交效率和灵敏度有重要影响。探针-III具有更长的接头，末端由更多的T碱基组成。探针与金的最小相互作用使其链能够在电解质中保持直立。与使用探针-I和探针-II的传感器相比，使用探针-III的SGGT传感器表现出最大的狄拉克点电压偏移(ΔV_Dirac)，如图3(d)所示。此外，MCH可用于竞争性地防止或消除表面ssDNA的非特异性相互作用，从而增强生物传感器对特定目标DNA的选择性。

此外，MCH在探针在金上形成直立构象方面也发挥了关键作用。Au传感门的界面工程以及探针和MCH SAMs的优化提高了固定地球化学探针对溶液中互补目标序列的可及性。这种优化提高了杂交效率，从而提高了灵敏度，如图3(e)所示。

图3 (a)使用不同金黄色葡萄球菌基因片段和相应的特异性ssDNA探针实施金黄色葡萄球菌检测的策略。(b)带有探针I的金黄色葡萄球菌SGGT生物传感器对浓度范围从10^-16 M到10^-10 M的目标ssDNA分子的响应。(c)带有探针II的金黄色葡萄球菌SGGT生物传感器对浓度范围从10^-17 M到10^-8 M的目标ssDNA分子的响应。(d)带有探针III的金黄色葡萄球菌SGGT生物传感器对浓度范围从10^-16 M到10^-10 M的目标ssDNA分子的响应。(e)使用各种探针的SGGT生物传感器在不同金黄色葡萄球菌ssDNA浓度下提取的ΔV_Dirac值。

研究人员继续进行了灵敏度和检测限的表征。图4(a)显示了优化的SGGT金黄色葡萄球菌生物传感器在0.1×PBS无核糖核酸酶电解质中检测目标DNA时测得的传输曲线。当目标ssDNA浓度增加时，SGGT生物传感器表现出更大的狄拉克电压偏移，证明了其在检测金黄色葡萄球菌ssDNA方面的高灵敏度。将其与不同浓度的目标ssDNA一起孵育，但仅观察到可忽略不计的响应，如图4(b)所示。为了表征SGGT生物传感器的线性，对从传递曲线中提取的ΔVDirac与目标ssDNA浓度的关系进行了拟合，并绘制在图4（b）中。在10^-16-10^-8 M的宽目标ssDNA浓度范围内获得了线性关系，相关系数为R²=0.984。图4（b）的插图显示了低浓度（<10^-16 M）金黄色葡萄球菌ssDNA的狄拉克点变化，该图显示了浓度范围从10^-17-10-¹⁴ M的线性关系。根据空白实验的噪声水平估算出LoD约为3 mV。SGGT生物传感器在10^-17 M下的响应明显高于噪声，而在10^-18 M下的响应接近该水平，证明该传感器可以实现低于10^-17 M的LoD。

这些结果表明，优化的SGGT生物传感器能够高灵敏度定量检测金黄色葡萄球菌ssDNA。图4(c)显示了SGGT生物传感器对10^-16和10^-14 M低浓度下目标ssDNA的实时通道电流(real-time channel current, I_D)响应。将目标ssDNA加入聚二甲基硅氧烷孔后，I_D逐渐增加，并在27 min内最终在目标与探针完全杂交后达到稳定状态。图4（e）绘制并拟合了提取的ΔI_D与目标ssDNA浓度（Lg[C(M)]）之间的关系。此处，浓度范围为10^-16-10^-12 M时的关系可以通过y₁=1.062x₁+18.873很好地拟合，而浓度范围为10^-12-10^-8 M时的关系可以通过y₂=0.269x₂+9.394很好地拟合。得到的相关系数R₁和R₂分别为0.999和0.981。此外，控制装置的不灵敏性能也表明SGGT在溶液环境中的长期稳定性，石墨烯通道与ssDNA干扰之间的相互作用可以忽略不计。图4（f）显示了ΔI_D与目标ssDNA浓度的关系以及在不同测试条件下获得的p值。目标浓度范围为10^-16 M-10^-8 M内，p <0.0001，证明SGGT传感器对于检测金黄色葡萄球菌ssDNA非常可靠。稳定性是生物传感器性能的重要指标，对信号准确性至关重要。新开发的SGGT的稳健性能凸显了其适用于生物传感器开发，表明其适用于各种生物传感应用。

图4 (a)在传感栅极电极上以不同浓度杂交目标分析物之前和之后测量的SGGT S.aureus生物传感器的传输曲线（V_DS=0.1V）。(b)SGGT S.aureus生物传感器和栅极电极上未进行探针修改的控制装置的ΔV_Dirac与目标分析物浓度的对数值的关系。(c)探针和目标ssDNA序列在10^-16 M和10^-14 M杂交后的实时通道电流响应（V_DS=0.1V，V_GS=0.3V）。(d)SGGT S.aureus生物传感器对不同浓度目标ssDNA的多重电流响应。(e)ΔI_D与目标ssDNA浓度的关系以及拟合曲线。(f)ΔI_D与目标ssDNA浓度的关系以及不同测试条件之间的P值。NC表示阴性对照，其中不存在核酸靶标(****P<0.0001)。

为了评估SGGT生物传感器的特异性，新开发的生物传感器用于测量其他非互补金黄色葡萄球菌ssDNA，即All-Mis、9-Mis和3-Mis。图5(a)显示了使用相同目标浓度100 pM的目标ssDNA和序列干扰（All-Mis、9-Mis、3-Mis）的转移曲线。与目标相比，所有序列干扰的ΔV_Dirac值都较小。图5(b)显示了由目标金黄色葡萄球菌DNA和序列干扰引起的提取ΔV_Dirac以及不同测试条件之间显著性检验的p值。目标金黄色葡萄球菌DNA产生的ΔV_Dirac比其他非互补ssDNA大得多。为了进一步评估所开发的SGGT金黄色葡萄球菌生物传感器的特异性，对金黄色葡萄球菌和其他几种常见致病菌进行了比较测试：副溶血性弧菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌。使用从细菌中提取的10^-13 M ssDNA进行测量。如图5（c）所示，金黄色葡萄球菌引起的ΔV_Dirac与干扰样品的ΔV_Dirac几乎相同，其中不同的单个干扰物与目标分析物混合。这证实了特异性响应仅由金黄色葡萄球菌产生。如图5(d)所示，含有这些致病菌干扰物的对照溶液（混合物1）的响应可忽略不计。相比之下，与目标金黄色葡萄球菌分析物（混合物2）混合的样品的ΔV_Dirac比混合物1高四倍。这些结果表明，金黄色葡萄球菌生物传感器对其他致病菌具有高度选择性。

图5 SGGT生物传感器的特异性评估。（a）浓度为10^-10 M时目标ssDNA和序列干扰（All-Mis、9-Mis、3-Mis）的转移曲线。（b）比较从转移曲线中提取的ΔV_Dirac值。结果表示为平均值±标准差，n=3，****p<0.0001。（c）将四种代表性致病菌中提取的ssDNA与测试样品中浓度为10^-13 M的金黄色葡萄球菌基因靶标混合后获得的测试样品的ΔV_Dirac值。（d）比较含有几种干扰致病菌的对照溶液（混合物1）及其与金黄色葡萄球菌基因靶标的混合物（混合物2）对应的ΔV_Dirac值。

最后，进行了金黄色葡萄球菌检测的系统演示。为了证明新开发的SGGT生物传感器在POCT中的潜在应用，开发了一种便携式智能传感系统。该系统能够同时进行信号收集、处理、传输和显示，将所有必要的功能整合到单个设备中。作为概念验证，使用商业细菌基因组试剂盒从不同金黄色葡萄球菌浓度的样本中提取基因组ssDNA进行测试。使用该检测系统，可以快速测量并记录生物传感器对不同金黄色葡萄球菌ssDNA浓度的传递曲线，如图6（d）所示。测量结果与实验室源测量单元测定的结果一致。图6（e）显示ΔV_Dirac与浓度的对数之间存在很强的线性关系，表明所提出的SGGT生物传感器对于定量检测金黄色葡萄球菌ssDNA序列非常有效。与传统PCR方法相比，基于SGGT的生物传感器无需扩增和标记。整个检测过程比传统方法更少繁琐的操作步骤，仅需27 min，耗时少得多。因此，新开发的SGGT生物传感器可以实现对金黄色葡萄球菌的灵敏、低成本和快速检测。此外，它比传统方法更有利于实现POCT，并且可以通过简单的传感门接口工程设计用于检测其他病原体。因此，它在临床诊断中具有良好的通用性。

图6 (a)通过无线通信由智能手机控制的便携式测试系统的照片，用于读取SGGT生物传感器。(b)一次性SGGT金黄色葡萄球菌生物传感器的照片。(c)在智能手机上运行的移动应用程序界面。(d)使用DNA提取试剂盒检测从细菌培养物中提取的金黄色葡萄球菌DNA序列。(e)电流响应与不同金黄色葡萄球菌浓度序列之间的关系。

综上所述，该研究开发了一种超灵敏且经济高效的SGGT生物传感器，用于无扩增、无标记和快速检测金黄色葡萄球菌DNA序列。传感电极的界面工程对于提高生物传感器对特定目标序列的灵敏度至关重要。这一发现强调了优化目标序列及其ssDNA探针的重要性。当使用由长接头组成的ssDNA探针时，基于SGGT的金黄色葡萄球菌生物传感器表现出最高的灵敏度，该探针末端的T碱基数量较多。这种特定设计旨在捕获包含最少T碱基的目标金黄色葡萄球菌序列。优化后的生物传感器可在27 min内快速检测提取的目标ssDNA，且具有10^-17 M的低LoD和10^-17-10^-8 M范围内的宽线性。该生物传感器还具有出色的特异性，可以将目标金黄色葡萄球菌ssDNA与各种类型的错配ssDNA区分开来。所提出的生物传感器还能够将其他常见致病菌与金黄色葡萄球菌区分开来。

此外，还展示了一种与开发的生物传感器集成的便携式智能传感系统，以促进对金黄色葡萄球菌基因组(ATCC6538)的实时和现场检测，LoD为10³ CFU/mL。这项研究为开发便携式生物传感器提供了一个有前途的平台，用于快速高灵敏度地检测食源性疾病，而无需预扩增和标记过程。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.153329