真菌毒素检测传感器-高效纳米酶

  玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种主要由镰刀菌产生的异雌性真菌毒素。它主要在玉米中检测到，在其他谷物中检测到的程度较低。ZEN极低的溶解度(每100毫升水中0.002 g)和较高的热稳定性增加了从食物链中去除ZEN的难度。ZEN的内源性雌激素样结构决定了其与细胞雌激素受体结合的能力及其生物积累。ZEN可以拮抗雌激素活性，改变雌激素的合成和代谢，或干扰雌激素受体的合成。因此，ZEN的雌激素样性质会导致体内激素平衡的紊乱，从而可能导致许多生殖疾病，如前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌或乳腺癌。鉴于ZEN对人类健康和农业生产的不利影响，欧洲食品安全局(EFSA)制定了食品中最大残留限量(MRLs)，即儿童和婴儿食品为20 μg kg - 1，谷类零食为50 μg kg - 1，未加工玉米为200 μg kg - 1 (Rogowska等人，2019年)。此外，中国规定了谷物及其产品中ZEN的最大残留限量。

  摘要：

  玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种广泛存在的具有雌激素样活性的非甾体真菌毒素。敏感、可靠的食品中ZEN的定量检测对保证食品安全和保障农业生产至关重要。本文将金属有机骨架纳米酶(MOFzyme)与透明质酸(HA)-DNA水凝胶结合，研制了一种设计合理的比色吸附传感器。通过链诱导杂交链式反应(HCR)将HA-DNA水凝胶沉积在双金属酶表面。依靠整合在水凝胶结构中的ZEN特异性适配体，ZEN分子的引入可以特异性地触发水凝胶网络的解体和囊化的MOFzyme的暴露。此外，水凝胶的崩解程度与ZEN的含量呈正相关，可以轻松实现ZEN的定量。得益于精巧的设计和双金属MOFzyme令人满意的催化性能和稳定性，以及DNA水凝胶吸引人的刺激反应性，开发的适变传感器展示了优越的分析性能和易于使用的特点。在最佳条件下，适达传感器的线性范围在0.001 ~ 200 ng mL−1之间，检测限(LOD)为0.8 pg mL−1。将该传感器成功应用于玉米和大豆样品中ZEN的定量检测，回收率为94.0% ~ 109.0%。该传感器有望成为食品或环境危害精确量化的通用平台。

  通过溶剂热反应得到原始的Ce-Zr双金属MOF，然后将其部分氧化为混价双金属MOFzyme。方案1描述了HA-DNA水凝胶包被MOFzyme的组装和应用方案。具体来说，核酸(1)通过三嗪桥与MOFzyme结合。此后，在核酸(2)中所含启动子单元的帮助下，链诱导的HCR发生在双旋盖单元(杂合双工(1)/(2))、HA-改性共聚物HA-(3)/(4)和共聚物HA-(5)内，从而使HA- DNA水凝胶覆盖在MOFzyme表面。核酸(2)中的启动子单元可与发夹(4)相互作用，从而展开(4)并暴露发夹(4)的其余部分。随后，在两个发夹的暴露区域之间产生链间桥接单元。展开发夹(5)将继续展开剩下的发夹(4)。因此，随着HCR反应的进行，水凝胶涂层逐渐沉积在MOFzyme的表面。有趣的是，在DNA水凝胶结构中包含了一个特异性适体序列。在ZEN存在的情况下，ZEN/适配体复合物的形成将诱导共聚物链的解离，进而导致HA-DNA水凝胶的解体和MOFzyme的暴露。

  在0-0.5 mM范围内改变TMB的浓度，测量反应速率，得到Michaelis-Menten曲线(图A)。由双倒数图(图B)可知，Michaelis-Menten常数(Km)和最大反应速度(Vmax)分别为0.17 mM和17.6 × 10−8 M s−1。氧化的Ce-Zr双金属MOF对TMB的Km比一些报道的以TMB为底物的纳米酶的Km要小(详见表S2)，这表明氧化的Ce-Zr双金属MOF对TMB具有更强的亲和力。综上所述，合成的氧化Ce-Zr双金属MOF具有良好的氧化酶活性，可以作为一种双金属MOF酶，进一步功能化用于生物传感应用。

  为了弄清双金属MOFzyme的催化机理，对原始Ce-Zr双金属MOF、暴露于TMB前的双金属MOFzyme和暴露于TMB后的双金属MOFzyme进行了x射线光电子能谱(XPS)分析，进行了价态分析。从Ce的高分辨率3d光谱(图C、D和E)可以看出，模式可以很好地反卷积为Ce4+和Ce3+对应的多个峰。原始Ce-Zr双金属MOF中Ce4+与Ce3+的比值为0.21:1。氧化处理后，该比例提高到1.55:1，表明约52%的Ce3+被氧化为Ce4+。在TMB照射120 min的氧化产物中，该比值为1.48:1，与催化反应前的结果没有明显变化。

  图2所示。氧化Ce-Zr双金属MOF的稳态动力学及催化机理分析。在pH值7.0和25◦C下，将TMB从0到0.5 m M变化得到氧化Ce - Zr双金属MOF的动力学曲线(A)，以及相应的 L i n e weaver - B u r k图(B)。暴露于TMB前后原始(C)和氧化Ce - Zr双金属MOF的3d XPS图(D和E)。使用DMPO作为阱(F)测量原始(黑色)和氧化Ce - Zr双金属MOF的EPR光谱(F)。

  元素组成和化学状态。在两种样品中均观察到Ce 3d、N 1s、C 1s和Zr 3d信号(图A)。此外，在DNA功能化的MOFzyme中出现了一个附加的P 2p信号，该信号明显来源于共轭核酸(1)/(2)。P 2p核能级谱在133.92和134.82 e V处可以很好地分解为两个峰，分别对应2p3/2和2p1/2(图B)。同时，叠氮功能化MOFzyme在DNA功能化前后的高分辨率C 1s谱可以分解为三个峰，分别对应于C - C/ C—C、C - o /C - n和COO−(图C)。C - o /C - n形式的C元素含量由DNA功能化前的4.75%增加到功能化后的9.74%，说明MOFzyme成功被核酸功能化。

  采用扫描电镜(SEM)对HA -DNA水凝胶包被MOFzyme的表面形貌进行了表征(图D)。水凝胶包被沉积在MOFzyme的表面。此外，水凝胶的形成并没有实质性地导致MOFzyme的团聚，这将有利于所开发的适溶酶传感器的实际应用。总之，通过核苷酸中的启动子单元引发的HCR反应，一个理想的HA -DNA水凝胶涂层成功地沉积在氧化双金属酶的表面。

  通过利用其他真菌毒素对PBS、玉米和大豆样品中ZEN含量定量的影响，评价了生物传感平台的选择性。如图C所示，在没有ZEN的情况下，其他浓度为ZEN十倍的真菌毒素在PBS中对系统的吸光度几乎没有明显的变化。在玉米和大豆样品中也观察到类似的结果。(S3A和B)。此外，同时添加10 n g m L - 1 ZEN和100 n g m L - 1其他真菌毒素的样品，无论是在缓冲溶液还是在食物基质中，与只添加ZEN的样品相比，吸光度变化不大(图D, S3C和D)。总的来说，所开发的方法对经常与ZEN共存的其他真菌毒素表现出高度的选择性。

  通过利用其他真菌毒素对PBS、玉米和大豆样品中ZEN含量定量的影响，评价了生物传感平台的选择性。如图C所示，在没有ZEN的情况下，其他浓度为ZEN十倍的真菌毒素在PBS中对系统的吸光度几乎没有明显的变化。在玉米和大豆样品中也观察到类似的结果。(S3A和B)。此外，同时添加10 n g m L - 1 ZEN和100 n g m L - 1其他真菌毒素的样品，无论是在缓冲溶液还是在食物基质中，与只添加ZEN的样品相比，吸光度变化不大(图D, S3C和D)。总的来说，所开发的方法对经常与ZEN共存的其他真菌毒素表现出高度的选择性。

  此前，我们的团队报道了一种基于DNA杂化双功能化MOF纳米容器(UiO-66-NH2 (Zr))和三价G4-DNAzyme的适配传感器，用于ZEN的特异性检测(Sun等人，2022)。与本研究的策略(使用双金属MOF zyme)不同，该策略的信号产生和扩增依赖于三价DNA过氧化物酶模拟酶(DNA zyme)的成功组装，因此需要更多的时间进行检测(超过2小时)。对于本研究开发的适配器，由于目标识别元件(DNA水凝胶中的适配体)和信号产生和扩增组件(MOF zyme)是集成在一起的，除了样品和有机底物外，不需要其他材料。目标诱导的水凝胶崩解和显色过程可以同时进行，消除了冗长的孵育程序的需要。此外，在反应结束后只需过滤即可测量反应信号，进一步缩短了测定时间。定量结果可在35 min内得到，考虑样品制备时间，总时间小于45 min。上述结果进一步证实了所开发方法的可靠性和易用性。

  结论：

  总之，基于HA -DNA水凝胶包被的双金属MOFzyme开发了一种新型的、灵敏的比色适配体传感器，以解决现有检测策略的不足。双金属的掺杂使Ce-Zr双金属酶具有较好的催化性能。同时，两个M(IV)节点也有效保证了MOFzyme催化性能的稳定性。此外，DNA水凝胶理想地保留了其中适体的识别敏感性和特异性，因此被赋予了特殊的刺激反应性。由于其精巧的设计和上述优点，所研制的适压传感器具有优异的分析性能和良好的易用性。值得注意的是，通过替换适体序列，所开发的方法可以很容易地外推到其他分析物，有望成为快速、准确定量食品或环境危害的一个有前景的平台。

  参考文献：Colorimetric aptasensor targeting zearalenone developed based on the hyaluronic Acid-DNA hydrogel and bimetallic MOFzyme

  DOI：10.1016/j.bios.2022.114366