一种多功能的纳米酶集成比色和光热横向流动免疫分析法，用于高灵敏度检测黄曲霉毒素

  比色免疫测定法，特别是比色横向流动免疫测定法(LFA)作为流行和有前途的护理点检测(POCT)策略，在无需其他复杂仪器的情况下通过肉眼直接读出进行现场紧急检查方面具有重大前景。因此，由于它们操作简单、便携和高经济性，特别是在资源有限的环境中，它们被广泛应用于疾病诊断、环境监测和食品安全领域。然而，比色法LFA依赖于颜色的出现/消失来识别分析物，其有限的灵敏度仍然不能适应其实际应用。最近，许多人致力于构建信号放大器以提高LFA的灵敏度。然而，这些LFA大多依赖于单一比色模式，这容易受到外部干扰，如不同的操作人员、非标准的测试过程和不同的外部环境。因此，在实际应用中，单模态检测方法无法满足复杂实际样品的高精度要求。虽然具有挑战性，但构建多模态LFA (m LFA)以满足高灵敏度和精确分析性能的多种需求是迫切需要的。

  摘要：

  视觉侧流式免疫测定法(LFA)已被公认为生物分析中有吸引力的护理点检测(POCT);然而，它们受到灵敏度不足和可靠性有限的限制。本文通过一步法将铜纳米颗粒的催化位点与固有的光热聚多巴胺(PDA)支架结合，设计了一个紧凑的Cu-锚定PDA (P Cu)作为多模态LFA (m LFA)的高效信号元件。该P Cu具有过氧化物酶模拟和光热特性，可以同时为黄曲霉的比色、放大比色和光热检测提供三重信号读出。具有吸引力的是，基于P cu的m LFA多重保证检测能够准确和灵敏地检测黄曲霉菌丝体生物量，可达0.45和0.22 n g mL−1，比传统比色法提高了19倍和40倍。此外，m LFA成功应用于实际样品，回收率为89.9 ~ 109%，具有较高的分析可靠性。该工作为高效的过氧化物酶模拟物和高性能光热多功能纳米材料的构建开辟了前景，为分析事件提供了一个潜在的多功能可视化POCT平台。

  该研究构建了一个紧凑而坚固的PCu组件，作为比色和光热mLFA放大平台的多功能纳米探针。为了更好地确认我们提出的mLFA平台的可行性和效率，以黄曲霉(a . flavus)作为概念验证靶标。在这里，通过简单的一步 d a介导的聚合掺杂和原位还原过程(Scheme 1A)，方便地制备了一个紧凑的多功能P Cu组件。DA是高效富集和原位沉积/还原Cu2+的聚合前驱体，无需额外还原剂、表面活性剂或聚合物的帮助，有效避免了复杂的制备过程。显然，与PDA支架一起继承的P Cu组装有效地获得了290 n m的直径(图a和图S1)，略大于PDA单独的直径(~250 n m，图S2)。这些结果与动态光散射(DLS)数据(图S3)一致。透射电子显微镜(TEM)显示，在PDA支架上观察到平均直径为13 n m的Cu N Ps球形结构(图S4)。

  环形暗场扫描透射电子显微镜(H A A D F- STEM)和相应的元素映射分析显示，PCu组件中的Cu、C、N和O元素分布均匀(图A插图)。能量色散x射线能谱(EDS，图B)也证实了P Cu组件中类似的化学成分。值得注意的是，这些成分元素在P Cu组件中均匀分布。表明P Cu组装成功(图C)。扫描电镜分析显示，在原位PDA支架上形成NPs后，PDA的光滑表面变得粗糙(图D和图S5)。在制备过程中，相对于负电荷PDA(−28.9 mV，图S6)，获得了一个带正电荷略多的PCu组件，zeta电位值降低了−15.2 mV，初步表明PCu组件制备成功。随后用x射线粉末衍射(XRD)研究了PCu组件的晶体结构。PCu组件的拉曼光谱在1360和1560 cm−1处出现了两个具有代表性的D带和G带峰。其中，由于与PDA相比，与邻苯二酚形成Cu-PDA, PCu组装的G带峰移至15 cm−1的低波数(图F)，证实了在PDA支架上成功构建NPs。

  除了固有的过氧化物酶样活性外，由于PDA支架的高消光系数，PCu组件还表现出优越的光热性能。在近红外激光(808 nm, 1.5 W cm−2)照射下，PCu溶液的温度表现出明显的激光功率和剂量依赖性。显然，与相对较低的激光功率(1.0 W cm−2,6.5分钟)相比，在808 nm激光照明(1.5 W cm−2,6.5分钟)下，PCu色散温度从27◦C急剧上升到55.9◦C(图D)。与空白组H2O相比，不同浓度的PCu组件也显示出剂量依赖性的温度升高(图E)。在808 nm激光照射下的PCu组件在5 min内的对应图像直接证明了PCu组件优越的光热性能(图F)。值得注意的是，随后的PCu光热检测是在25◦C的固定室温下进行的，以消除不同室温的干扰(图S10)。这些结果证实了PCu组件可以吸收808 nm激光并将其转化为热能。因此，所实现的PCu组件也可以作为一种迷人的光热剂来有效地识别目标。因此，PCu组件优越的过氧化物酶样光热活性为后续构建多模态比色-光热生物传感器提供识别抗体的便利。

  在测试线上捕获黄曲霉，在对照线上捕获山羊抗兔抗体(IgG)。PCu@pAb探针作为信号标签，用于提供常规比色法、过氧化物酶辅助放大比色法和光热三重读出。将PCu@pAb探针和黄曲霉分析物引入mLFA条带后，测试线上的Nb捕获黄曲霉形成Nb- a。通过pAb与黄杆菌抗原的特异性识别机制，将PCu@pAb探针的pAb同时固定在检测线上。这样，Nb-抗原- PCu@pAb在检测线上形成了三明治结构，导致在检测线上产生了PCu@pAb的特征灰色带。随着黄曲霉浓度的增加，测线的比色信号进一步增强，从而触发黄曲霉的比色鉴定。同时，模拟过氧化物酶的PCu@pAb探针在TMB和H2O2的辅助下产生了明显的蓝色，实现了过氧化物酶辅助的黄杆菌抗原扩增比色检测。值得注意的是，在测试线上具有固有光热性能的PCu@pAb可以作为黄曲霉的高精度定量的辅助信号读出器，溶液中被分析物越多表明温度信号越高。注意，控制线作为测试突出功能的指示符，在检测过程中应该始终可见。总之，提出的mLFA可以作为一个有价值的病原体多模式平台。

  通过探索TMB/H2O2辅助扩增和光热分析的最佳样品垫、NC膜、检测线上捕获抗体、探针浓度、迁移和检测时间，优化mLFA的传感性能。特别是样品垫的类型和NC膜对PCu@pAb探针迁移有很大影响。在这里，两个商业样品垫涉及Fusion 3和Fusion 5，三个商业NC膜包括CN 95, IAB 120和IAB 130同时优化。如图S15所示，Fusion 3/CN 95的图像和灰度强度是最适合PCu@pAb探针迁移的样品垫和NC膜。一个理想的mLFA应该在保持最小背景的同时提供高效的信号增益。因此，最佳捕获抗体和PCu@pAb探针浓度是高效mLFA性能的关键。显然，在相同条件下，Nb作为捕获抗体在测试线上的比色强差比比pAb作为捕获抗体在测试线上的比色强差比增加了5倍(图S14)，说明Nb是优化的捕获体。随着PCu@pAb浓度的增加，测试线的信号强度逐渐增强(图A)，而过载的PCu@pAb表明，多余的PCu@pAb会导致不理想的阴影颜色。因此，24 μg L−1的PCu@pAb是mLFA性能的最佳浓度。然后，探索mLFA的迁移时间，以评估其优化的分析性能(图S16)。随着时间的延长，测试线的信号强度逐渐加深，直到9 min达到饱和平台，表明测试过程可以在9 min内完成。除了迁移时间外，进一步研究了TMB/H2O2溶液的检测时间和近红外辐照对mlfa介导的放大比色和光热检测的影响。可以看出，随着检测时间的延长，检测线的比色信号强度和温度逐渐升高，在30 s和3 min内均达到相对稳定(图4B和4C)，可见放大比色和光热检测的最佳检测时间分别为30 s和3 min。值得注意的是，TMB/H2O2溶液的加入不会导致TMB在裸NC膜上的氧化，进一步说明了源于PCu纳米酶的测试线的颜色变化(图S17)。通过优化实验条件，成功构建了高效稳定的黄曲霉mLFA。

  通过ΔT = 10.714 + 3.014 × lgC (R2 = 0.994)的回归方程得到ΔT与黄曲霉浓度的对数(0.001 ~ 100 μg mL−1)之间的线性关系(图C)。根据3σ/S，过氧化物酶样扩增比色法和光热法的LOD分别为0.45和0.22 ng mL−1，甚至优于大多数基于免疫分析的黄曲霉方法(表S2) (Tsai and Yu, 1997;薛等人，2013;Yong和Cousin, 2001)。与传统比色法LFA (8.7 ng/mL)相比，灵敏度分别提高了19倍和40倍。在花生基质中观察到mLFA的类似检测性能，比色法、放大比色法和光热法的LOD分别为2.2、0.20和0.14 μg g−1(玉米基质的LOD分别为1.8、0.16和0.11 μg g−1)(图S18)。此外，现有的mLFA检测范围也比较宽，对于不同水平要求的分析物具有很大的潜力。此外，mLFA的检测范围也比较宽，对不同水平要求的分析物具有很大的潜力。结果表明，PCu@pAb-mediated mLFA为黄曲霉的高效敏感平台。作为一个鲁棒的多功能传感平台，特异性是估计我们提出的mLFA的关键参数。在这里，mLFA被一系列干扰的外来微生物挑战，包括黄曲霉、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、木霉、赭曲霉、赭曲霉和花粉青霉。显然，与分析物触发的强比色/光热信号强度相比，不同干扰微生物产生的信号强度几乎接近系统的背景信号(图D)。这一结果表明我们的mLFA具有特定的识别性能。除了mLFA的具体性能外，PCu@pAb探针和mLFA的稳定性是POCT应用的另一个重要参数。如图S19所示，在15天和90天内，相对于新制备的PCu@pAb探针和mLFA，它们对黄芽孢杆菌检测的PCu@pAb探针和mLFA比色信号强度的影响可以忽略不计。这些结果表明，PCu@pAb探针和mLFA在进一步的应用中提供了长期存储的重要前景。

  结论

  总之，利用简单的一步自聚合和原位还原过程，成功开发了一种紧凑的多功能PCu组件，用于高效的mLFA组合检测平台。通过将比色法和光热法有效地集成到一个实体中，PCu显著提高了比色法mLFA的灵敏度和可靠性。多功能PCu介导的mLFA可在9，9.5和12 min内对黄曲霉病原菌提供比色、放大比色和光热三重信号。以pcu为基础的mLFA体系具有过氧化物酶模拟物和光热特性，有助于黄针菇菌丝体生物量高效、灵敏的鉴别，LOD分别为0.45和0.22 ng mL−1，是传统比色分析法(LOD为8.7 ng mL−1)的19倍和40倍。此外，mLFA对黄曲霉具有较高的特异性，同时在真实样品中也表现出较好的分析性能。与传统的比色LFA相比，我们的PCu介导的mLFA提供了有价值的见解，通过多个传感事件的组合，详细合理地构建了更有效和更健壮的POCT策略，为食品安全和生物分析提供了更多功能和更有吸引力的分析纳米平台。

  参考文献：A versatile nanozyme integrated colorimetric and photothermal lateral flow immunoassay for highly sensitive and reliable Aspergillus flavus detection

  DOI：10.1016/j.bios.2022.114435