引言

细菌感染是严重威胁公众健康的全球性问题。细菌耐药性的不断增加,使得常规的抗菌策略变得举步维艰。同时,细菌生物膜的形成也加剧了这一问题,为细菌提供了额外的保护,进一步阻碍了抗生素的作用。因此,急需开发新型高效的抗菌策略。

光热疗法(PTT)和化学动力疗法(CDT)展现出了卓越的治疗潜力和最小创伤性。PTT利用近红外光将光热剂转化为局部升温,有效杀灭细菌并促进创面愈合。CDT利用过氧化酶(POD)模拟纳米酶,催化内源性过氧化氢生成高水平的羟基自由基(·OH),发挥抗菌作用。PTT与CDT的联合疗法大幅提升了抗菌和创面修复的疗效。

单原子纳米酶(SAzymes)由于理论上100%的原子利用率、高电导率和热导率,以及出色的POD活性而受到广泛关注。SAzymes中Fe、Cu和Mn活性位点也表现出光热效应,使其成为PTT-CDT联合疗法的理想选择。然而,单一金属活性位点的光热转换效率和催化活性仍然不足,需要较高剂量才能达到理想疗效。高剂量可能会对正常组织和细胞造成毒性或炎症反应,导致细胞损伤和死亡。因此,迫切需要开发更有效的SAzymes,以更低的剂量实现满足的PTT-CDT疗效。

双金属单原子纳米酶相比单一活性位点展现出更优异的光热和催化性能。本研究开发了一种Fe和Cu双金属单原子纳米酶(FeCu BSNs),通过热放大型纳米酶催化策略实现细菌感染的高效治疗。由于Cu SAzymes具有出色的光热效应,将Cu引入Fe位点有望增强FeCu BSNs的光热转换效率。如预期所见,FeCu BSNs的光热转换效率高达56.26%,是Fe SAzymes(29.69%)和Cu SAzymes(25.55%)的近两倍。得益于Fe和Cu位点的协同作用,FeCu BSNs展现出卓越的POD活性(752.25 U mg^-1),是Fe SAzymes(323.45 U mg^-1)的2.3倍。此外,FeCu BSNs的POD活性在光热效应的放大下进一步提升。FeCu BSNs介导的PTT-CDT联合疗法通过产生高水平ROS和热杀伤作用,有效抑制细菌生长,预防生物膜形成,并促进创面愈合。值得注意的是,FeCu BSNs的使用剂量仅为10 μg mL^-1,比报道的SAzymes低一个数量级。这项工作突出了低剂量SAzymes通过PTT-CDT疗法实现最佳抗菌和创面修复效果的光明前景。

方案一 用于高效PTT-CDT抗菌和伤口愈合的FeCu BSNs的示意图。a) FeCu BSNs的合成过程；b) 用于抗菌和伤口愈合的FeCu BSNs图解。

结果与讨论

I. 合成与表征

FeCu BSNs通过一步热解法合成,以SiO₂纳米粒子为模板。首先,将含有SiO₂、NH₄Cl、Fe(NO₃)₃·9H₂O、Cu(NO₃)₂和柠檬酸的水溶液冷冻干燥得到固体混合物。然后在惰性气氛(Ar)下,将固体混合物在900°C焙烧。柠檬酸在SiO₂颗粒表面碳化,形成N掺杂碳,NH₄Cl作为氮源。接着,通过5wt.%的氢氟酸溶液去除SiO₂模板,最终得到多孔的FeCu BSNs。

透射电子显微镜(TEM)图像表明FeCu BSNs呈现层次化的多孔结构。X射线粉末衍射(XRD)图谱显示,FeCu BSNs中存在石墨碳的特征峰,但没有Fe、Cu金属或其化合物的特征峰,表明Fe和Cu以单原子分散状态存在。这与倍频扫描透射电子显微镜(AC-HAADF-STEM)图像显示的均匀白点分布一致。能量色散X射线光谱(EDS)元素分布图进一步证实了C、N、O、Fe和Cu元素在样品中的均匀分布(图1d)。X射线光电子能谱(XPS)结果表明,FeCu BSNs中存在石墨化N、吡啶N、金属-N键、吡咯N和氧化N等多种氮官能团,以及Fe²⁺/³⁺和Cu¹⁺/²⁺状态。ICP-OES结果显示FeCu BSNs中Fe和Cu的含量分别为0.46 wt%和0.31 wt%。综上所述,Fe和Cu单原子以均匀分散的形式存在于FeCu BSNs中。

II. 多功能性能

研究了FeCu BSNs在808 nm激光照射下的光热效应。结果显示,FeCu BSNs溶液温度随浓度、功率密度和照射时间的增加而升高。使用0.63 W cm^-2的功率密度,FeCu BSNs的光热转换效率高达56.26%,是Fe SAzymes(29.69%)和Cu SAzymes(25.55%)的近两倍。这得益于Cu掺杂调节了FeCu BSNs在近红外区的光吸收特性。FeCu BSNs在5次激光照射-冷却循环中保持稳定的光热性能,验证了其作为高效光热剂的应用潜力。

FeCu BSNs表现出优异的POD样活性,在催化H₂O₂分解生成·OH方面明显优于Fe SAzymes。动力学分析结果显示,FeCu BSNs对H₂O₂和TMB的亲和力(K_m)均较低,催化效率(k_cat/K_m)显著高于Fe SAzymes。FeCu BSNs的比活性高达752.25 U mg^-1,几乎是Fe SAzymes (323.45 U mg^-1)的2.3倍,也优于大多数报道的单原子酶。电子自旋共振(ESR)光谱进一步证实,FeCu BSNs能够在H₂O₂存在下产生·OH。

III. 体外抗菌性能

采用铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)和大肠杆菌(E. coli)考察了FeCu BSNs的协同抗菌作用。结果表明,FeCu BSNs浓度依赖性杀灭P. aeruginosa,当浓度达到40 μg mL^-1时,菌存活率为39%。单独使用H₂O₂或NIR照射与5 μg mL^-1 FeCu BSNs,杀菌率分别为26%和32%。而H₂O₂和NIR协同使用时,杀菌率高达89%。E. coli也表现出类似结果。同样条件下,Fe SAzymes的抗菌能力明显弱于FeCu BSNs。Live/Dead染色进一步验证了这些结果。

机理研究表明,FeCu BSNs单独作用对细菌表面影响较小。但在H₂O₂或NIR辐照条件下,细菌结构受到严重破坏。FeCu BSNs、H₂O₂和NIR的联合处理进一步加剧了细菌损伤。这归因于FeCu BSNs优异的光热转换效率导致的局部升温以及其POD活性催化H₂O₂生成高水平ROS。这些结果表明,FeCu BSNs介导的CDT在NIR照射下的抗菌效果显著增强,PTT对催化疗法产生了协同增强作用。

IV. 抗药性细菌和生物膜性能

FeCu BSNs对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)这一典型的耐药菌表现出优异的抑制效果。在100 μM H₂O₂存在下,FeCu BSNs 10 μg mL^-1即可达到有效抗菌浓度,这反映出MRSA比革兰氏阴性菌表现出更强的耐药性。单独使用H₂O₂或NIR照射时,FeCu BSNs对MRSA抑制作用有限。而在FeCu BSNs、H₂O₂和NIR照射的联合作用下,MRSA生长受到96%的抑制。细菌细胞膜破坏和ROS水平的增加验证了这一协同杀菌机制。

细菌生物膜能有效保护细菌免受免疫系统和抗生素的攻击。FeCu BSNs通过POD活性产生ROS以及光热效应,显著降低了MRSA生物膜的形成。这可归因于ROS诱导的胞外聚合物降解,以及局部加热导致的细菌代谢受损。因此,FeCu BSNs介导的PTT-CDT联合疗法能够高效抑制MRSA及其生物膜形成。

V. 创面愈合增强

FeCu BSNs通过协同的抗菌和抗炎作用,促进了创面的修复和愈合。FeCu BSNs能够有效杀灭细菌,预防细菌感染,并减轻炎症反应。此外,其光热效应还可诱导血管生成,进一步加速创面愈合。与单独使用NIR或H₂O₂相比,FeCu BSNs的PTT-CDT联合疗法大幅提高了创面愈合的速度和质量。这归功于其多重协同生物学效应,为临床创面修复提供了一种新的有效策略。

总之,本文开发了一种Fe-Cu双金属单原子纳米酶,实现了高效的光热化学动力学联合抗菌和创面修复。FeCu BSNs通过放大纳米酶催化反应的热效应,表现出卓越的POD活性和光热转换效率。这种低剂量的SAzymes在PTT-CDT协同疗法中展现出优异的抗菌和创面愈合能力,为临床感染性疾病治疗和组织修复提供了新的可能。

图1 FeCu BSNs的结构特征

图2 FeCu BSNs的POD活性和光热性能

图3 FeCu牛血清白蛋白的体外抗菌活性

图4 FeCu BSNs对耐药菌的体外耐药性

图5 FeCu BSNs促进体内感染伤口愈合和再生

图6 免疫荧光分析与生物安全

参考文献：https://doi.org/10.1002/adhm.202403920