仿生热点工程：超灵敏SERS传感器在细菌检测中的应用探索

1. 引言

细菌引起的传染病已成为全球公共卫生的主要威胁，每年导致数百万人死亡和住院。快速、灵敏地检测病原菌对于预防感染大规模暴发至关重要。传统的细菌分析技术如平板菌落计数、聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）操作复杂且耗时，限制了其临床应用。近年来，表面增强拉曼光谱（SERS）因其快速、无损和高分辨率特性被认为是理想的替代方法，特别是“三明治”结构的SERS生物传感器在快速准确检测细菌方面得到了广泛应用。然而，SERS传感器在极低浓度下的灵敏度仍需提高。

SERS灵敏度主要受“热点”影响，这指的是两个相邻等离子体纳米粒子之间电场增强的局部区域。目前，研究者们关注等离子体纳米粒子的结构和形态设计，以增强热点强度。同时，粒子间距离和富集模块对SERS灵敏度也至关重要。通过模仿自然系统，如果实挂满树枝，可以设计树枝状结构的纳米载体，从而缩小粒子间距并增加热点密度。此外，利用磁性纳米粒子作为富集模块，可以在信号模块和富集模块之间产生强化电场，从而进一步增强热点密度。

本研究提出了一种基于生物激发协同热点工程策略的超灵敏SERS三明治传感器（USSB），用于细菌检测。该传感器采用树突状介孔二氧化硅纳米颗粒（DMSN）负载含有拉曼标签的等离子体纳米粒子，并通过豆豆蛋白a功能化捕获细菌。磁性Fe3O4纳米粒子包覆Au外壳以增强等离子体激发，并修饰细菌识别分子作为富集模块。研究结果表明，该传感器对金黄色葡萄球菌具有超高检测灵敏度（7 CFU/mL），能够在真实血液样本中快速准确地检测细菌性脓毒症。这一生物启发协同热点工程策略为超灵敏SERS三明治生物传感器的构建提供了新的思路和应用前景。

方案1. 构建用于病原菌检测的超灵敏SERS夹层传感器的仿生协同HS工程策略示意图。

2. 结果与讨论

D-Au@Ag的制备与表征

从自然界中悬挂着果实的树枝获得灵感，研究者们将信号模块中的等离子体纳米粒子（NPs）锚定在仿生树突状纳米载体上，以缩小它们之间的纳米间隙。首先，采用Stöber法和溶胶-凝胶法合成了具有独特枝晶微观结构的生物激发树突状介孔二氧化硅纳米颗粒（DMSN），其平均直径约为170 nm，并通过N2吸附-解吸分析确认了其多孔特性。随后，在DMSN上原位生长小尺寸的Au NPs，作为稳定较大尺寸Au NPs的成核位点。引入4-MBA拉曼标签与DMSN-Au偶联以增强SERS信号。此外，通过核壳结构设计等离子体NPs（Au@Ag），提高了等离子体激发能力。X射线衍射（XRD）和能量色散光谱（EDS）分析表明，Ag均匀分布在Au NPs表面，成功形成了D-Au@Ag。傅里叶变换红外光谱（FTIR）进一步确认了材料的结构特征。这些研究为超灵敏SERS传感器的开发奠定了基础。

Fe3O4@Au的制备与表征

为了提高热点（HS）的数量和强度，研究者对富集模块中的磁性纳米粒子（NPs）进行了等离子激元激发，该模块由Fe3O4核和Au壳组成（Fe3O4@Au）。首先，通过溶剂热反应合成了直径约为70 nm的Fe3O4 NPs，显示出石榴状形貌。然后，使用阳离子亲水性聚乙烯亚胺（PEI）自组装在Fe3O4表面，以提高其分散性。接下来，Au种子通过静电作用锚定在Fe3O4-PEI表面，并通过原位还原HAuCl4诱导Au种子生长，形成均匀的Au壳层。紫外-可见光谱显示Fe3O4@Au在600 nm处具有特征性等离子共振峰，表明其优异的等离子体性能。研究还表明，Fe3O4@Au复合材料具有良好的超顺磁性和快速分离能力，为目标分子的富集提供了良好潜力。

D-Au@Ag-C和Fe3O4@Au-Ab的制备及其细菌捕获/富集性能

在4-MBA的辅助下，研究者将D-Au@Ag表面与刀豆蛋白A（Con A）偶联，制备了具有广谱细菌捕获能力的信号模块（D-Au@Ag-C）。修饰后，zeta电位由-15.5 mV升高至-31.1 mV，且D-Au@Ag-C的SERS信号较D-Au@Ag有所改善，表明Con A成功耦合。同时，利用金黄色葡萄球菌抗体修饰的Fe3O4@Au纳米粒子作为富集模块（Fe3O4@Au-Ab），也显示出良好的识别能力。实验结果表明，D-Au@Ag-C能有效捕获金黄色葡萄球菌，而Fe3O4@Au-Ab在不同浓度下的富集效率高达79%。这些结果证明了开发的信号和富集模块在细菌捕获和富集方面的优越性能，为特定细菌检测提供了简便的方法。

USSB传感器中SERS信号放大的理论与实验验证

为了提高USSB传感器中的热点（HS）数量和强度，研究者在信号模块中集成了生物激发的树突状纳米载体，并在富集模块中集成了等离子体磁性纳米粒子（NPs）。通过理论模拟和实验验证，发现DMSN能够有效缩小信号模块中等离子体NPs之间的纳米间隙，从而增强已有HS的强度，并建立新的HS。实验结果表明，D-Au@Ag的拉曼信号显著增强，验证了DMSN缩小间隙的有效性。此外，富集模块提供了进一步产生HS的可能性，模拟结果显示在Fe3O4@Au和Au@Ag之间有效建立了HS，SERS增强因子达到最大值2.7×10⁷。组装后的USSB传感器显示出良好的细菌捕获和富集性能。

USSB传感器在人工样品中的细菌检测性能

为了评估USSB传感器对金黄色葡萄球菌的识别和检测能力，研究者监测了不同浓度细菌培养的增强拉曼信号。结果显示，拉曼峰强度与细菌浓度呈正相关，并在20至105 CFU/mL范围内建立了良好的线性关系，线性回归方程的相关系数为R² = 0.98。通过计算，检出限（LOD）为7 CFU/mL，验证了传感器的超灵敏检测能力。此外，USSB传感器表现出良好的重复性，相对标准偏差仅为4.5%。在与其他干扰菌的比较中，USSB传感器对金黄色葡萄球菌具有优异的选择性，即使在复杂介质如血液中也能保持较高的SERS信号。

USSB传感器在真实脓毒症样品中的细菌检测

脓毒症是一种由致病菌引起的严重感染综合征，具有高发病率和致死率。为验证USSB传感器在细菌感染诊断中的可行性，研究者将其应用于脓毒症小鼠血液样本的细菌检测。实验结果显示，在高达100 μg/mL的浓度下，USSB传感器与红细胞的相容性良好，未观察到溶血现象。使用该传感器对感染小鼠的血液样本进行检测，结果表明SERS信号均匀且具有良好的再现性，与金标准血培养方法一致，回收率接近100%。这些结果证明USSB传感器在真实脓毒症样品中的卓越检测准确性，展现了其在临床应用中的超灵敏细菌感染诊断潜力。

3. 总结

本研究设计了利用生物启发的协同热点（HS）工程策略，开发了一种超灵敏的SERS三明治细菌传感器。该传感器结合了生物启发的树突状信号模块和加载有Au@Ag的等离子体纳米粒子，富集模块则基于包裹有Au壳的磁性Fe3O4纳米粒子。理论模拟和实验结果表明，DMSN有效缩小了等离子体纳米粒子之间的间隙，提高了信号模块中的HS强度。同时，等离子体磁富集模块作为辅助器件，建立了大量额外的HS，从而增强了SERS性能。该传感器能够快速准确地检测人工和真实脓毒症样品，展现出超高灵敏度和选择性，为细菌感染的早期诊断提供了巨大潜力。提出的生物启发协同HS工程策略为构建超灵敏SERS三明治生物传感器提供了一种有效模式。