活细菌检测新方法：原子力显微镜联合机器学习，让死活细菌无处遁形

检测细菌活力是医学、药学、微生物学和食品工业等各个领域的当务之急，凸显了其广泛的重要性。然而，有效检测细菌死亡的可靠方法仍存在挑战。过去，许多研究主要集中于促进细菌生长或阻碍细菌生长的条件。最初，基于培养的技术成为细菌活力评估的主要方法，其中活细菌在特定培养基中茁壮成长，而死细菌则不会。然而，这种方法培养时间较长。因此，人们开发了不依赖培养的方法，包括荧光染色、活细胞聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)、基于转录的方法和基于细胞代谢的评估以及NO排放传感器。这些方法的引入标志着细菌活力评估的重大进步，但每种方法都具有固有的局限性，阻碍了它们在某些情况下的广泛应用和有效性。广泛使用的基于膜完整性的荧光染色方法采用碘化丙啶(propidium iodide, PI)，通过渗透受损的细胞膜并与核酸结合，随后可通过荧光显微镜或流式细胞术检测。然而，这种方法面临局限性，因为完整的细菌细胞膜即使在细菌失活后仍能存在。因此，PI在细菌丧失活力后数小时甚至数天内都无法穿透细胞，导致低估死亡细菌。

此外，长时间暴露于染料可能会降低细菌活力或诱导细胞死亡。在PCR测试中，样本需要用细胞毒性染料处理，这可能会对细胞造成不可逆转的损害。使用氧化还原染料评估活菌的催化能力，为细菌活力评估提供了潜力，但可能缺乏对休眠细胞的敏感性。显然，迫切需要一种通用、快速、非破坏性且精确的方法，能够轻松准确地识别活细菌和死细菌。

细胞纳米力学的变化是疾病和衰老的特征之一。原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）能够在生理条件下进行非破坏性成像，并能获得从蛋白质到细胞和组织的生物系统的生物物理特性。AFM力谱提供有关刚度和弹性、粘度和能量耗散等力学参数的信息，这些信息将细胞力学与细胞过程和状态联系起来。例如，借助AFM，可以通过力学分析将肿瘤细胞与正常细胞区分开来，即使细胞表现出相似的形状，显示转移性肿瘤细胞比正常间皮细胞要软得多。对于细菌，死亡的大肠杆菌的杨氏模量是健康细菌的2倍。因此，细菌的纳米力学可以作为反映其生存能力的重要指标。最近，有报道称通过监测AFM悬臂的振动来实时表征细菌代谢活动，可以快速检测细菌的耐药性。然而，现有系统依赖于AFM悬臂作为纳米机械传感器，检测大量活细菌产生的波动。遗憾的是，这种配置缺乏区分单个细胞活力的能力。然而，利用细菌固有的独特纳米机械特性，为在细胞水平上检测细菌活力提供了一种潜在且有希望的途径。

AFM力谱数据包含大量有关被检测物体机械性能的信息，分析起来相当困难。通过利用机器学习和大数据分析等数据驱动技术，可以有效地挖掘AFM数据，从而揭示生物系统的新见解。机器学习作为一种数据分析方法，使用各种统计、概率和优化方法，使计算机能够从现有示例中“学习”，并从大型、嘈杂或复杂的数据集中检测难以识别的模式；据报道，它还可用于分析AFM数据，进行疾病诊断、力谱分类和评估、探针质量检测，以及预测干细胞分化和其他医学应用。最近，有几项研究报告称，通过使用机器学习算法分析细菌形态来识别细菌的活力。多组学分析已被用来显示部分反硝化细菌的选择性富集。然而，仅凭形态学无法识别具有完整细胞膜的死细菌。此外，用于机器学习的图像或视频等数据的高维性导致计算复杂度很高。

近日，中国科学院深圳先进技术研究院郭师峰团队在Cell Reports Physical Science期刊上发表了题为：AFM-based nanomechanics and machine learning for rapid and non-destructive detection of bacterial viability论文。

为解决上述问题，本研究将AFM力谱与机器学习算法相结合以预测细菌活力。如图1所示，采用液态AFM可以让我们获取活和死的革兰氏阴性菌(大肠杆菌[E. coli])和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌[S.aureus])的形态和力曲线(力-距离[F-D]曲线)数据。随后对F-D曲线进行处理，可以提取包含变形、细菌弹簧常数和杨氏模量值的重要数据点。这些提取的参数作为我们计算框架的输入，构建了一个堆叠分类器。该分类器运行迅速、自主，能够快速、自动化地有效识别细菌活力。

图1 AFM与机器学习算法结合快速检测革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌活力的示意图

首先，测定制备好的细菌的存活率。在训练机器学习模型时，需要识别与标签相对应的输入数据，即活细菌或死细菌。因此，为了确定细菌的存活率，使用LIVE/DEAD BacLight细菌活力试剂盒对固定化细胞进行染色。如图2A和2B所示，活细菌染成绿色，而死细菌染成红色（用红色圆圈标记）。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活菌比例都超过96%，确保了较高的存活率，从而获得了活菌的机械性能。然而，由于完整的细胞膜为染料的进入提供了一道屏障，这一步骤可能会导致对死细菌的低估。使用紫外线杀死的细菌通过基于培养的方法评估死亡率。在持续20分钟的紫外线照射下，该组中没有大肠杆菌的菌落（图2C）。而对照组中则出现了大量的菌落（图2D），总数为1163个。同样，对于金黄色葡萄球菌，紫外线照射30分钟后没有形成任何菌落（图2E），而对照组中则观察到了500个菌落（图2F）。平板培养结果证明，紫外线照射20和30分钟即可完全杀死大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

图2 通过荧光染色和培养检测细菌活力。

(A和B) 用LIVE/DEADBacLight细菌活力试剂盒染色的活大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的荧光显微镜检查。绿色荧光代表活细菌，而红色荧光标记表示死细菌（用红色圆圈标记）。黄色虚线框显示活细菌或死细菌的放大视图。

(C和D) 用紫外线照射20分钟和未经紫外线处理的大肠杆菌琼脂培养板的照片。

(E和F) 用紫外线照射30分钟和未经紫外线处理的金黄色葡萄球菌琼脂培养板的照片。

接下来研究了活细菌和死细菌的形态差异，分析了扫描电子显微镜(scanning electron microscopy, SEM)和AFM图像。对于大肠杆菌，SEM（图3A-3D）和AFM图像（图3E-3H）均显示活或死形态下的特征杆状。图3B和3D分别显示了代表性放大的活细菌和死细菌图像，表明活大肠杆菌和紫外线杀死的大肠杆菌（图3A和3C）在形态上没有显著差异。图3E-3H显示了在PBS溶液中获得的2D和3D AFM图像。对于活大肠杆菌，长度、宽度和高度分别测量为2.3±0.4、0.9±0.1和0.5±0.1 mm（平均GSD，n=20），而死大肠杆菌的相应大小分别为2.5±0.6、0.8±0.2和0.5±0.1 mm。

使用SPSS通过t检验对活菌和死菌之间的形态差异进行统计分析。如图3I-3K所示，活菌和紫外线灭活大肠杆菌的长度、宽度和高度值没有显著差异（p>0.05）。对于金黄色葡萄球菌，AFM图像（图3L和3M）和SEM图像显示活菌和死菌都接近球形。活体金黄色葡萄球菌的直径和高度分别为0.7±0.1和0.5±0.1 mm（n=20），与直径和高度分别为0.8±0.1和0.6±0.1 mm的死体金黄色葡萄球菌的数据无统计学差异（图3N和3O）。结果表明，紫外灭活的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌能够保持其初始形态，因此无法通过直接比较它们的形态来区分活力。紫外线照射会阻断DNA转录和复制，最终导致细胞死亡。这种灭菌方法的目标不是细胞膜，这可能是紫外灭活细菌仍能保持完整形态的原因。因此，需要一种更可靠、有效的方法来区分它们。

图3 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活菌和死菌形态。

(A) 活大肠杆菌菌落的代表性SEM图像。

(B) 单个活大肠杆菌的放大视图。

(C) 紫外线杀死的大肠杆菌的代表性SEM图像。

(D) 单个死大肠杆菌的高倍SEM显微照片。

(E和F) PBS中PLL涂层培养皿上固定的活大肠杆菌的代表性AFM图像（F捕获3D视图）。

(G和H) 死大肠杆菌的AFM图像（H捕获3D视图）。

(I–K) 活大肠杆菌和死大肠杆菌的长度、宽度和高度值的统计分析。这里显示的是至少十次独立AFM实验中从20个活大肠杆菌和20个死大肠杆菌获得的平均值（蓝色星号）、中位数、下四分位数和上四分位数（方框）、异常值（紫色方块）和标准差（晶须）。

(L和M) 分别为单个活金黄色葡萄球菌和死金黄色葡萄球菌的AFM图像。

(N和O) 活金黄色葡萄球菌和死金黄色葡萄球菌直径和高度值的统计分析。数据是从至少五次独立AFM实验中的20个活金黄色葡萄球菌和20个死金黄色葡萄球菌获得的。

研究人员继续进行了活细菌和死细菌的纳米机械特性分析，利用活菌和死菌的纳米力学特性作为机器学习的输入特征检测细菌活力。为此，分别在PBS溶液中用AFM测量经紫外线处理前后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，采用定量成像模式，记录每个像素的F-D曲线，从而可以同时获得样品的形貌和力学特性。在测量过程中，AFM探针在压电扫描仪的驱动下反复接近和缩回样品，并以逐点方式扫描细胞表面，记录每个像素的力曲线，以揭示纳米力学特性的空间分布。由于细菌的纳米机械性能并不完全均匀（中间比边缘略硬），因此应分析在不同区域获得的F-D曲线以得出具有代表性的纳米机械数据。我们选择了同一大肠杆菌的极点和中心区域（图4A–4C中用红色星号标记）的三条F-D曲线进行分析；因此，每种细菌总共选择了九条F-D曲线。可以通过将施加的力与压痕深度关联来研究细菌的纳米机械性能，因此仅显示和分析了接近曲线。图4D–4F显示了在不同位置获得的活和死大肠杆菌的典型力-压痕曲线。同样，图4G–4I注释了金黄色葡萄球菌上接近曲线的三个区域。图4J–4L显示了活和死金黄色葡萄球菌对应于不同位置的代表性力-压痕曲线。在同一区域，活细菌和死细菌的曲线形状存在显著差异，表明纳米机械性能存在显著差异。

图4 获得活菌和死菌的F-D曲线及其对应的代表性接近曲线的选定位置示意图。

(A–C) 同一大肠杆菌上的三个选定位置用红色星号标记，通常是细胞的两个极点和中心。

(D–F) 用于计算变形、细菌弹簧常数和杨氏模量值的活菌和死菌的代表性接近曲线。

(G–I) 同一金黄色葡萄球菌上的三个选定位置用红色星号标记。

(J–L) 活菌和死菌的代表性接近曲线。

为了获得紫外线处理后细菌纳米机械性能的变化，对力-压痕曲线进行了分析，获得了变形、细菌弹簧常数和杨氏模量的变化。对于细菌来说，压痕曲线有两个区域，即低力时的非线性区域和高强度时的线性区域。如图5A所示，反映细胞壁弹性的杨氏模量值可以通过拟合非线性区域来估算，而与膨压相关的细菌弹簧常数可以通过拟合线性区域来获得。活和死大肠杆菌的此类机械数据分布如图5B所示。对于活大肠杆菌，变形、细菌弹簧常数和杨氏模量分别为28±8 nm、16±4 nN/mm和1.0±0.7 MPa（图5C），而对于死大肠杆菌，变形、细菌弹簧常数和杨氏模量分别为16±4nm、29±8 nN/mm和3±2 MPa（图5D）。t检验结果显示，活大肠杆菌和死大肠杆菌之间的d、kb和E值存在统计学上的显著差异（p<0.001）。对于活金黄色葡萄球菌，d、kb和E的值分别为30±9 nm、20±6 nN/mm和1.0±0.5 MPa（图5E），而死金黄色葡萄球菌的相应值分别为17±4 nm、36±10 nN/mm和3±2 MPa（图5F），也显示出显着差异（p<0.001）。这些值与之前的报告非常吻合。如图5G所示，结果表明死细菌的变形大幅减少，而细菌的弹簧常数和杨氏模量急剧增加，这意味着紫外线灭菌后刚度增加。然而，上述统计分析仅提供活菌和死菌之间纳米机械性能的定性区分，而不能直接确定细菌活力，因为活菌与死菌的纳米力学参数分布存在部分重叠，活菌与死菌之间无明显界限，参数间亦无明显的函数关系。因此，需要将纳米力学特性与机器学习算法相结合来检测细菌活力。

图5 从力-压痕曲线中提取的三个典型机械特征的分布。

(A) 从力-压痕曲线中提取的三个机械特征的示意图。细菌弹簧常数通过用胡克定律（橙色区域）拟合线性部分来确定，而杨氏模量则通过Sneddon模型拟合到非线性区域（绿色）。

(B) 活大肠杆菌和死大肠杆菌的变形、细菌弹簧常数和杨氏模量的可视化。

(C 和 D) 活大肠杆菌(C)和死大肠杆菌(D)的典型力-压痕曲线（接近）和d、kb和 E的频率分布直方图。所有直方图均有来自20个大肠杆菌的180个数据点。

(E 和 F) 活金黄色葡萄球菌(E)和死金黄色葡萄球菌(F)的典型力-压痕曲线和d、kb和 E的频率分布直方图。所有直方图均有来自21种金黄色葡萄球菌的189个数据点。

(G）两种细菌在活体和死体状态下的d、kb和E的平均值。误差线对应于标准误差（t检验，*p < 0.001）。

基于上述研究，建立了细菌活力分类的堆叠模型。选择stacking分类器作为集成学习模型。细菌的三个纳米机械特征，即变形、细菌弹簧常数和杨氏模量，被确定为模型的输入，以预测细菌的活力。模型框架如图6所示。首先生成基级分类器，然后通过组合基级分类器的输出来学习元级分类器。应用留一法或交叉验证程序来生成用于学习元级分类器的训练集。

图6 用于检测细菌存活或死亡的堆叠算法流程图。

数据集分别包括356个死标记和活标记的大肠杆菌样本以及372个死标记和活标记的金黄色葡萄球菌样本，按照报道的比例7:3.35随机分成训练集和测试集。分类的有效性可以通过四个参数来评估，即真阳性tp（正确识别的类实例数）、真阴性tn（正确识别的不属于该类的示例数）、假阳性fp（错误地分配给该类）和假阴性fn（未被识别为类示例）。考虑上述参数的四个指标，即准确率、精确率、召回率和F1分数用于评估模型的性能。使用初始超参数进行训练的结果显示过度拟合导致测试和训练准确率之间的泛化差距很大。为了解决过度拟合，使用网格搜索来确定最佳超参数通过对模型的超参数进行微调，解决了过拟合问题。随后，对测试集中的堆叠模型的性能进行了评估，大肠杆菌的准确率、精确率、召回率和F1得分分别为0.9533、1.0、0.9090和0.9524，金黄色葡萄球菌的准确率、精确率、召回率和F1得分分别为0.9821、0.9825、0.9825和0.9825。

为了进一步验证堆叠分类器的有效性，使用擅长处理非线性数据分类的典型机器学习算法进行了比较分析，。使用混淆矩阵显示大肠杆菌的分类结果（图6A）。此外，通过接收者操作特性(ROC)曲线对分类器性能进行全面评估（图6B）。此外，使用堆叠模型对金黄色葡萄球菌进行分类的混淆矩阵和ROC曲线如图6C和6D所示。ROC曲线通过曲线下面积(AUC)评估分类结果的有效性。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的AUC值分别为0.95和0.98，证明了所提出的分类器的稳健性和可靠性。

图7 堆叠分类器的模型性能。

(A 和 B) 大肠杆菌分类的结果(A，混淆矩阵；B，ROC曲线，AUC = 0.95)。

(C 和 D) 金黄色葡萄球菌分类的结果(C，混淆矩阵；D，ROC曲线，AUC = 0.98)。

综上所述，这项研究介绍了一种检测细菌活力的通用方法，展示了它对两种细菌——革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的有效性。该方法利用从AFM力谱中提取的定量纳米机械特性，结合机器学习算法，标志着与传统技术的重大区别。与使用细菌图像或视频进行机器学习的方法不同，新方法利用纳米机械参数作为输入，最终形成堆叠集成学习算法。这种开创性的融合实现了卓越的性能，可以准确检测细菌活力，准确率超过95%。使用纳米机械特征代替图像作为输入可以减少数据空间的维度，避免过度的数据分析，并且节省时间。传统方法（如培养繁殖能力）虽然无损但需要较长的培养期，但在检测不可培养或休眠细菌时往往会受到限制。使用荧光染色的膜完整性测试对于完整的死细菌来说可能不太准确，并且可能因使用染料而导致细胞毒性，尽管使用商业试剂盒相对容易实现。测量细胞代谢的氧化还原染料提供了一种可行但灵敏度较低的检测休眠细胞的方法，而RNA分析等分子技术则以侵入性和获得高质量RNA提取的挑战为代价提供了卓越的精度。AFM方法可以无损地区分具有完整形态的活细菌和死细菌，这证明了它优于传统方法。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.xcrp.2024.101902