病毒制造新纪元：高密度Sf9细胞培养开启rAAV中试规模工艺的新篇章

基因治疗是一种利用遗传物质（如DNA或RNA）来治疗或预防疾病的医学方法。它基于分子生物学和分子遗传学的原理，通过改变个体的基因表达或修复异常基因来治疗疾病。基因治疗的目标是提供持久的治疗效果，特别是对于那些目前无法治愈的遗传性疾病。基因治疗被研究用于治疗多种疾病，包括遗传性疾病（如囊性纤维化、镰状细胞性贫血、某些类型的失明）、癌症、HIV/AIDS以及某些罕见疾病。目前在基因治疗领域中使用最多的载体是病毒载体，如重组腺相关病毒、recombinant adeno-associated virus（rAAV）或非病毒载体（如脂质体）等。近年来，基因治疗药物已广泛上市，其疗效和潜力得到了确认。因此，扩大其工业规模生产至关重要。

rAAV是基因治疗应用的最佳载体之一，而基于Sf9细胞培养的杆状病毒表达载体系统（BEVS）是rAAV生产的常用工具。Xinran Li等人为实现高密度培养Sf9细胞和提高rAAV的生产效率，对Sf9细胞的培养过程以及参数进行了调整。目前，分批生产是生产工艺中培养Sf9细胞并使其生产rAAV的最常用方法，而Xinran Li等人则选择使用摇瓶进行补料分批培养法培养Sf9细胞。

实验方法

1. Sf9细胞培养

Sf9细胞在Sf900 III培养基中，以27°C和130rpm的条件培养。Sf9细胞以5×10⁵cell/mL活细胞浓度接种于1L生物反应器中，InsectPro培养基作为补充剂后续添加到培养基中。Sf9细胞被rBV-GOI（凝血因子IX）和rBV-CapA1（血清型6）从杆状病毒库中感染，每个细胞的感染复数（MOI）为0.05 IVP/cell。每天测定活细胞浓度和细胞活性以及使用Cedex生物分析仪测量细胞悬浮液中葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、氨和乳酸脱氢酶（LDH）的浓度。当细胞活性降至30%以下时，培养结束。

2. 重组杆状病毒（Recombinant baculovirus，rBV）构建和rAAV载体收获

通过将含有特定目标基因GOIs或Rep/Cap基因的bacmid转染Sf9细胞，分别产生rBV-GOI或rBV-CapA1两种重组杆状病毒（rBV），这一过程遵循Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书进行。使用流式细胞仪来定量检测标记的基于BV的病毒表面蛋白gp64的表达。通过12000 rpm，10min离心收集细胞和上清液，用含有1×磷酸盐缓冲液（PBS）、1% Triton X-100和10 mmol/L MgCl2的裂解缓冲液裂解细胞1h，再次以12000 rpm，10min离心去除细胞碎片。然后，将细胞培养上清液和裂解上清液合并作为rAAV上清液，向其中加入工作浓度为100 U/mL的BenzoNuclease，在室温下孵育1h。通过定量聚合酶链反应（qPCR）使用CMV特异性引物来定量rAAV滴度。

实验结果

图 1 不同细胞培养工艺对细胞生长曲线的影响

研究人员首先在摇瓶中开发了Sf9细胞的补料分批培养过程，从第5天开始每天添加2%的进料总体积时，如图1所示，补料分批培养与分批培养相比，最大细胞密度增加119%，达到2.86×10⁷ cells/mL；在此细胞培养工艺的基础上制备了rAAV，与分批培养相比，在补料分批工艺中，最大细胞密度增加85%，达到2.28×10⁷ cells/mL。

图 2 不同细胞培养工艺对rAAV滴度的影响

在此细胞培养工艺的基础上制备了rAAV，如图2所示，与分批培养相比，在补料分批工艺中rAAV滴度增加约9倍，达到1.6×10¹² VG/mL。

Sf9细胞生产rAAV生物反应器工艺的优化及中规模放大生产应用

实验室规模生物反应器工艺参数的优化基于在摇瓶中进行的rAAV生产工艺，在将实验室1L规模放大到50L规模过程中，研究人员以生产rAAV滴度作为参考指标选择温度、pH值、溶氧量DO、搅拌速度这4个反应器参数进行正交实验，结果显示，在不同规模的细胞中，气体分压和代谢物曲线的趋势相似，值也相似，表明细胞培养工艺得到了良好的放大。此外，研究者们检测了pO2、pCO2和代谢物，发现不同规模的细胞培养中这些曲线有很强的相似性，表明放大过程是线性的。

结论

1. 该团队研究成功建立了通过高密度Sf9细胞培养生产rAAV的中试生产工艺，证实了Sf9细胞生产rAAV规模扩大策略与生物反应器生产的规模扩大模式流程一致，提供了一个应用Sf9细胞大规模生产产品的成功案例。

2. 这项研究对于降低AAV产品的成本具有重要意义。

3. 该方法不仅限于本案例研究，还可以扩展到其他生物技术过程。

参考文献

[1] Li X, Gu J, Wu H, et al. Pilot-scale process development for recombinant adeno-associated virus (rAAV) production based on high-density Sf9 cell culture[J]. Virology Journal, 2024,21(1):281.