1. 引言

食源性病原体污染是一个严重的公共卫生问题，威胁粮食安全和农业生产力。常见的病原体如鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌每年导致数百万人感染，尤其在欠发达地区。由于这些病原体具有相似的生长需求，共同污染的风险增加，因此迫切需要同时检测多种病原体。传统的微生物检测方法如平板计数、聚合酶链反应（PCR）和测序过程复杂且耗时，限制了快速有效的微生物鉴定。免疫层析分析（ICA）因其便携性、快速性和多靶点分析能力而受到关注，但传统ICA使用胶体金纳米颗粒（AuNPs）作为信号报告器，导致灵敏度降低。为提高灵敏度，研究者探索了自组装策略，通过聚集AuNPs来增强信号输出。同时，免疫磁分离与ICA的结合被认为是一种有效策略，通过磁操作从复杂样品中分离和富集目标分析物。随着磁光双功能纳米杂化材料的发展，该技术得到了显著增强。

本文采用离散分布自组装策略合成了一种荔枝形磁金纳米杂化材料（MSiAuTA），其结构包括磁性纳米颗粒核、负载油胺-AuNPs的中间介孔二氧化硅模板和荔枝外果仁样单宁酸层。这种独特结构确保了快速有效的磁响应，同时最大限度地减少了磁屏蔽效应并提高了胶体稳定性。经过抗体偶联后，MSiAuTA作为磁富集和比色信号扩增标记，在多重ICA平台上实现了对大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的超灵敏检测（图1）。该平台支持便携式光学扫描仪和智能手机读数，适用于资源有限环境中的快速筛查。这项研究为食源性病原体的检测提供了新的方法和技术支持。

图1. MSiAuTA-mICA同时定量检测大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的示意图。(a) MSiAuTA具有高度保留的磁性，出色的生物相容性和出色的等离子体活性。(b)磁选程序示意图。(c) MSiAuTA-mICA的定性和定量检测过程示意图。

2. 结果与讨论

MSiAuTA的合成与表征

MSiAuTA的合成策略如图2a所示。首先，采用溶剂热法合成了平均直径约为190 nm的磁性纳米颗粒（MNPs），并通过SEM和TEM确认了其次级纳米团簇的存在。随后，MNPs作为核心，通过winor-iii工艺外延生长中间介孔二氧化硅（mSiO2）层，形成明确的核壳结构。接着，将平均直径约为10 nm的疏水油胺金纳米颗粒（OA-AuNPs）自组装到硫代MSi模板上，证实了其在孔道内的存在。最后，涂覆亲水性单宁酸（TA）层以实现相转移，形成坚固的TA层。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）图像显示，MSiAuTA具有均匀分布的MNP核心和OA-AuNPs，并被TA层包裹。

图2. (a) MSiAuTA合成示意图。MNP (b)、MSi (c)、MSiAu (d)和MSiAuTA (e)的SEM图像，MNP （f, j）、MSi （g, k）、MSiAu （h, l）和MSiAuTA （i, m）的TEM图像，MSiAuTA的EDX元素映射（n1-7）和元素线扫描(o)。

MSiAuTA的合成过程分析了其水接触角（WCA）和多孔结构的演变（图3）。最初，MNP和MSi模板表现出较高的亲水性，WCA分别为53.2°和77.6°。通过巯基锚定疏水AuNPs后，MSiAu的WCA显著增加至107.5°，表明疏水AuNPs占据了树突通道。由于TA层的存在，MSiAuTA的WCA降低至46.2°，增强了其生物应用适用性。氮气吸附-解吸等温线显示，MNPs核心初始孔隙结构微小，但经过mSiO2层外延生长后，BET表面积显著增加至331.38 m²/g。填充OA-AuNPs后，BET表面积和总孔体积分别降至150.47 m²/g和0.32 cm³/g，说明OA-AuNPs渗透了介孔通道。最终涂覆TA层后，孔隙结构完全封闭，使得MSiAuTA表面光滑。XRD谱图显示MNPs和OA-AuNPs的晶体结构保留良好。XPS分析确认了各元素的存在，并显示FeII含量的增加。动态光散射（DLS）测量表明，MSiAuTA在水相中具有良好的分散性和胶体稳定性。磁强计分析表明，尽管整合过程导致饱和磁化强度降低，但MSiAuTA仍表现出超顺磁特性。这些特性确保了从复杂样品中快速有效地分离和富集目标分析物。

图3. (a)如图所示的OA-AuNPs和纳米结构的示意图（上）和水接触角（下）。纳米结构的氮吸附-脱附等温线(b)和BJH孔径分布(c)如图所示。(c)紫外-可见吸收光谱。MNP核心和MSiAuTA纳米杂化物的宽范围XRD谱图(e)、XPS谱(f)。(g) MNP核心和MSiAuTA纳米杂化物的高分辨率fe2p XPS光谱。如图所示，纳米结构的水动力直径分布(h)和ζ电位(i)。(j)室温磁化磁滞回线。插图：外磁场采集的MSiAuTA纳米杂化体照片。

评价MSiAuTA的抗体偶联效率

在MSiAu表面包裹亲水相转移层对维持OA-AuNPs的等离子体活性、增强MSiAuTA的分散性和促进生物偶联至关重要。研究中选择天然多酚单宁酸（TA）和铁离子（FeIII）作为有机配体和无机交联剂，通过TA的氧化和自聚合在MSiAu表面涂覆TA层。TA层的丰富羟基增强了MSiAuTA对抗体的粘附能力，支持通过氢键、离子和疏水相互作用与抗体偶联。此外，TA的儿茶酚基团通过化学反应促进与抗体氨基的偶联。

与传统的二氧化硅包封方法相比，MSiAuTA的抗体偶联效率更高，尤其在低抗体浓度下表现出优越性。尽管在高浓度下MSiAuSi显示出更好的偶联效率，但可能降低抗体生物活性。实验结果表明，MSiAuTA@dAb探针在比色信号强度上优于MSiAuSi@dAb，且在两周后仍保持良好的活性（图4）。这些发现证明了MSiAuTA在生物应用中的潜力。

图4. MSiAuTA在抗体偶联中的优势。(a)抗体与MSiAuTA的键合力示意图。(b)抗体偶联效率定量分析示意图。(c) OD450 nm对anti-E的回归方程。大肠杆菌O157:H7 dAb浓度。(d)不同抗体浓度下MSiAuTA的偶联效率。(e)不同抗体浓度下MSiAuSi的偶联效率。从MSiAuTA-ICA和MSiAuSi-ICA中提取不同浓度anti-E的条带原型(f)和比色信号(g)。大肠杆菌O157:H7 dAb。(h)储存时间对MSiAuTA@dAb的影响。大肠杆菌O157:H7和dAb浓度分别为1 × 10⁵ CFU/mL和10 μg/mL。

MSiAuTA-mICA的定量性能

为了优化MSiAuTA-mICA的性能，研究者系统地调整了关键条件，包括溶液pH、抗体饱和量、测试线上抗体数量、探针含量和磁分离时间（图5）。通过分析PBS溶液中大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的浓度，测试条显示出良好的灵敏度，分别在9.8 × 10² CFU/mL和4.9 × 10² CFU/mL时可见红色条带。大肠杆菌的LOD为9.8 × 10² CFU/mL，比传统方法灵敏度高16.3倍；鼠伤寒沙门氏菌的LOD为4.9 × 10² CFU/mL，高32.6倍。此外，MSiAuTA-mICA在牛奶样品中有效检测两种病原体，证明了其在复杂基质中的可行性和鲁棒性。

图5. MSiAuTA-mICA的定量性能。用于检测大肠杆菌O157:H7 (a)、鼠伤寒沙门氏菌(b)和两种不同浓度食源性致病菌(c)的MSiAuTA-mICA条带原型。MSiAuTA-mICA试纸条对不同浓度的大肠杆菌O157:H7 (d)、鼠伤寒沙门氏菌(e)和联合两种食源性致病菌(f)的光密度比。ODT/ODC比值与大肠杆菌O157:H7 (g)、鼠伤寒沙门氏菌(h)和联合两种食源性致病菌(i)浓度的线性关系。*表示检测限。

智能手机调制便携式MSiAuTA-mICA

为满足资源有限的终端用户需求，研究者开发了一款名为“Color Picker”的智能手机应用程序（图6），用于从条带图像中提取TL和CL信号强度，以替代昂贵的便携式条带扫描仪。为确保拍摄时光照一致，设计了一种便携式照明设备，该设备由3D打印的支架、光学系统和电源组成。测试条在双LED灯照明下放置，智能手机相机正上方拍摄图像。通过“Color Picker”应用处理图像，测量RGB值以分析结果。对于大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌，检出限分别为9.8 × 10² CFU/mL和4.9 × 10² CFU/mL，显示出该方法在各种环境中进行即时检测的便利性和可靠性。

图6. 智能手机辅助MSiAuTA-mICA分析。基于智能手机的成像装置示意图(a)、光路图(b)、软件界面图(c)。(d)基于智能手机的成像装置对不同浓度大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的MSiAuTA-mICA条R值比（RT/RC）。RT/RC比与大肠杆菌O157:H7 (e)和鼠伤寒沙门氏菌浓度(f)的线性关系。

MSiAuTA-mICA分析性能评价

为了评估MSiAuTA-mICA在实际应用中的效果，研究者使用含有大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的低浓度牛奶样品（8 CFU/mL）。结果显示，该系统在5小时内成功检测到这两种病原体，满足了对低水平食源性病原体的快速筛选需求。通过与其他9种常见食源性致病菌的比较，MSiAuTA-mICA表现出高选择性，仅在靶向病原体上产生明显的红色条带。定量实验表明，在不同浓度下，MSiAuTA-mICA的回收率在86.1%至108.3%之间，变异系数低于13%，显示出良好的准确性和精密度。此外，该系统在水、生菜、鸡肉等复杂基质中也能有效检测大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌，证明了其在食品安全监测中的可靠性（图7）。

图7. MSiAuTA-mICA的分析性能。(a) MSiAuTA-mICA法检测不同时间LB培养物预孵育后大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌。MSiAuTA-mICA对大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌等干扰菌的条带原型(b)及其对应的信号强度(c)。(d) MSiAuTA-mICA对5种模拟样品中大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌检测回收率的热图。

3. 总结

本研究设计了一种荔枝形状的MSiAuTA纳米杂化体，并将其应用于多重免疫层析分析（mICA）中，作为磁分离工具和比色信号放大标签。这种纳米杂化体能够同时高灵敏地检测大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌，显著降低了未加工食品样品中的杂质干扰。分散在中间介孔二氧化硅（mSiO₂）模板上的油胺金纳米颗粒（OA-AuNPs）保持了优异的等离子体活性，同时减少了对磁性纳米颗粒（MNP）磁力线的影响。单宁酸（TA）层则增强了纳米杂交体的分散性和胶体稳定性，并确保了抗体偶联的良好生物相容性。定量评价表明，该传感器对目标病原体具有高灵敏度和选择性。基于智能手机的便携式读写设备进一步拓展了MSiAuTA-mICA在资源受限环境下的应用场景。此外，通过对各种人工污染食品基质的检测，验证了该平台的准确性、稳定性和实用性。因此，MSiAuTA-mICA代表了一种有前景的快速诊断平台，能够促进多种食源性病原体的敏感和同时检测。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.157262