基于Fe3O4@MOF复合材料的多重荧光传感器：一种新型病原菌检测方法

1. 引言

细菌作为重要的病原体，涉及食物中毒和传染病等健康问题，每年影响全球约6亿人，导致42万人死亡。细菌感染的常见症状包括发烧、头痛和腹泻等。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌是主要的致病菌。传统的细菌检测方法如平板计数虽然是金标准，但需时长达72小时，限制了其应用。酶联免疫吸附测定（ELISA）和聚合酶链反应（PCR）等方法虽然灵敏度高，但也存在复杂性和成本问题。近年来，核酸引导内切酶（如Argonautes）在分子诊断中展现出革命性潜力，能够在不需要特定序列的情况下靶向DNA，提高多靶点检测的可能性。然而，高温条件限制了其在某些分析中的应用。为此，研究者们成功表达了一种中温活性的Ago（CbAgo），以拓展其在生化分析中的应用。为了提高检测效率并降低成本，研究者们提出了一种基于熵驱动电路（EDC）的无酶信号扩增策略。EDC利用线性单链DNA进行信号放大，相较于传统方法具有更少的序列约束和更高的稳定性。此外，金属有机框架（MOF）材料因其高孔隙率和良好的热稳定性被广泛用于生物传感器中。

本研究提出了一种新型的MOF@aptamer介导的熵驱动荧光生物传感器（MAEA生物传感器），结合中温CbAgo，实现对病原菌的多路检测，无需DNA提取和扩增（图1）。磁性Zr基MOF被用作病原菌适体分离和富集的载体，具备快速分离和节省时间的优势。此外，基于Zr的MOF能够容纳更多的寡核苷酸，从而提供更多的反应位点。EDC反应是一种高效的等温无酶信号扩增策略，具有独特的无发夹扩增系统和不可逆的双链DNA配合物，展现出优良的热稳定性。经过EDC反应后，低浓度的cDNA输入可转化为高浓度的引导DNA输出。MAEA生物传感器利用CbAgo在引导DNA的作用下，能够特异性识别并精确切割互补的单链DNA，从而实现对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的同时检测。

图1. 基于MAEA生物传感器的多路无扩增病原菌熵驱动荧光生物传感器示意图。(A) Fe₃O₄/SiO₂/UiO66/Aptamer同时识别两种致病菌。(B) EDC驱动低浓度cDNA转化为高浓度gDNA。(C) CbAgo用于同时检测两种致病菌。

2. 结果与讨论

Fe₃O₄/SiO₂/UiO66/Apt的制备与表征

Fe₃O₄/SiO₂/UiO66/Apt的合成过程如图2A所示，相关表征实验验证了Fe₃O₄/SiO₂/UiO66和Fe₃O₄/SiO₂/UiO66/Apt的成功形成。扫描电镜（SEM）显示合成的Fe₃O₄纳米颗粒表面光滑且尺寸均匀。为了增强稳定性，Fe3O4表面涂覆了SiO2壳层，形成Fe₃O₄/SiO₂，保持圆形和均匀表面。SiO₂的负电荷增加了库仑斥力，有效防止磁性颗粒聚集。UiO66通过水热反应均匀生长在Fe₃O₄表面，TEM图像确认了元素的均匀分布。Zeta电位分析显示，Fe₃O₄/SiO₂/UiO66/Apt的负电荷高于Fe₃O₄/SiO₂/UiO66，表明适配体的负电荷影响了材料的性质。FTIR和XPS分析进一步证明了各组分之间的化学结合，证实了Fe3O4/SiO2/UiO66/Apt的成功合成。最终，MNP150及其共轭物MNP150-SA的形貌均匀，且成功偶联，表明材料修饰成功（图2）。

图2. 复合材料的表征。(A) Fe3O4/SiO2/UiO66/Apt的制备示意图。(B) Fe3O4, (C) Fe3O4/SiO2, (D， E) Fe3O4/SiO2/UiO66的SEM图像。(F) Fe3O4/SiO2/UiO66的TEM图像及Fe、Si、Zr元素的TEM元素映射图。(G) Fe3O4、Fe3O4/SiO2、Fe3O4/SiO2/UiO66、Fe3O4/SiO2/UiO66/Apt和UiO66的Zeta电位。(H) Fe3O4、Fe3O4/SiO2、Fe3O4/SiO2/UiO66和Fe3O4/SiO2/UiO66/Apt的FTIR光谱。(I) Fe3O4/SiO2/UiO66和Fe3O4/SiO2/UiO66/Apt的高分辨率P - 2光谱。(J) Fe3O4/SiO2/UiO66/Ap的高分辨率o1s光谱。

MAEA生物传感器的可行性验证

末端磷酸化的适配体通过强的Zr-O-P键直接共轭到UiO66表面，修饰效率高。然而，高浓度的磷酸根离子会导致Zr-MOF支架分解，释放装载在UiO66上的适配体。在磷酸三钠溶液中，加入Fe₃O₄/SiO₂/UiO66/Apt后，经过磁分离和聚丙烯凝胶电泳（PAGE）分析，结果显示适配体在溶液中游离，且其浓度显著高于100 nM。适配体对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的亲和力实验表明，适配体优先与致病菌结合，而不是与cDNA结合，验证了适配体的选择性和有效性（图3）。

图3. Fe3O4/SiO2/UiO66/Apt及其适配体亲和力的可行性研究。(A) Fe3O4/SiO2/UiO66/Apt的解离过程。(B)适配体与Fe3O4/SiO2/UiO66结合的PAGE表征。(C) Image J软件定量分析了5 μg Fe3O4/SiO2/UiO66/Apt中适配体的含量。致病菌与(D)大肠杆菌和(E)金黄色葡萄球菌适配体结合的PAGE表征。

为了验证EDC策略的有效性，研究者通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的产物。结果显示，车道1至5分别对应单链Q、P、gDNA、F和cDNA的条带，而车道6显示Q、P和gDNA（1:1:1）成功杂交形成的混合物。在存在目标cDNA时，P带增强，表明cDNA成功取代P形成Q/gDNA/cDNA复合物。当Q/P/gDNA复合物与F链同时存在时，仅观察到微弱泄漏。最终结果表明，通过EDC循环反应，靶cDNA能够有效生成更多的gDNA，验证了EDC反应扩增策略的成功（图4）。

图4. 熵驱动DNA网络的可行性验证。(A)熵驱动dna循环过程。(B)大肠杆菌熵驱动DNA网络中样品的PAGE表征。(C)金黄色葡萄球菌的熵驱动DNA网络中样品的PAGE表征。

研究验证了多功能酶标仪同时检测两种荧光分子的可行性，FAM和VIC分别在495 nm和535 nm处检测荧光强度。结果表明，当激发波长为495 nm时，仅FAM产生线性相关的荧光信号，而VIC无明显信号；反之亦然。这证明了多重荧光信号读出系统的有效性，且无信号串扰。在比较单独检测与同时检测两种荧光分子的强度时，结果显示无明显差异，验证了系统的准确性。此外，CbAgo的切割特性通过PAGE实验得到了确认，显示其能够有效切割目标DNA（图5）。最终，该MAEA生物传感器实现了无需提取DNA即可同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。

图5. CbAgo切割两个靶标的可行性验证。(A) CbAgo同时切割两个靶标示意图。(B)验证CbAgo对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌裂解原理的PAGE（从左至右）。(C) CbAgo同时切割了两个靶标的线性范围。

MAEA生物传感器病原菌单次检测

MAEA生物传感器被用于检测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，并评估其定量能力和有效性。结果显示，荧光信号强度与大肠杆菌浓度呈正相关，在10²至10⁶ CFU/mL范围内，荧光强度与浓度的对数值（log CFU/mL）线性相关，线性方程为Y = 9.22×10⁵X - 2.56×10⁵（R² = 0.9908）。对于金黄色葡萄球菌，荧光强度在0至10⁸ CFU/mL范围内逐渐增加，检测线性范围为10²至10⁶ CFU/mL，线性方程为Y = 6.52×10⁵X + 4.15×10⁵（R²= 0.9969）。这些结果表明，该MAEA生物传感器能够有效定量分析这两种致病菌（图6）。

图6. MAEA生物传感器单次检测病原菌的分析性能。(A)不同浓度大肠杆菌的荧光强度。(B) MAEA生物传感器检测的大肠杆菌标准曲线。(C)不同浓度金黄色葡萄球菌样品的荧光强度。(D) MAEA生物传感器检测金黄色葡萄球菌的标准曲线。

MAEA生物传感器在病原菌多路检测中的应用

基于MAEA生物传感器的单次分析可行性，研究进一步探讨了其多次检测能力。在最佳条件下，分析了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在0至10⁸ CFU/mL范围内的连续稀释度，结果显示荧光信号强度与细菌浓度呈正相关，并在10²至10⁶ CFU/mL范围内线性相关（图7）。MAEA生物传感器对这两种细菌的检出限分别为79和68 CFU/mL。该传感器的优势包括高活性的CbAgo酶、无需DNA提取步骤、较短的反应时间以及优越的特异性。与标准qPCR方法相比，MAEA生物传感器在多个性能指标上表现良好，能够实现高灵敏度和准确性的致病菌检测。

图7. 所建立的MAEA生物传感器用于病原菌多重检测的分析性能。(A)不同浓度大肠杆菌和金黄色葡萄球菌样品的荧光强度。(B) MAEA生物传感器在10² ~ 10⁶ CFU/mL范围内检测大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的标准曲线。所提出的MAEA生物传感器对(C)大肠杆菌和(D)金黄色葡萄球菌的选择性优于其他常见病原体的荧光读数。目标大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及干扰菌浓度为10⁶ CFU/mL。

在验证了MAEA生物传感器的分析性能后，研究进一步测试了其在肉类和临床样品中检测致病菌的实用性。通过对20份鸡肉和20份猪肉样品的检测，结果显示大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的阳性率，且与标准盘子计数法相比，MAEA生物传感器在区分阳性和阴性样品方面表现出高一致性。此外，在32例患者和10例健康人的临床样本中，感染患者的荧光信号显著高于健康个体，MAEA生物传感器对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的检测准确率分别为88%和87%（图8）。该传感器具有检测时间短、灵敏度高、准确性强等优点，能够同时检测多种病原体，并且不需要复杂的DNA提取和扩增步骤。与其他检测方法相比，MAEA生物传感器在多重检测能力、灵敏度和分析时间等方面具有明显优势。

图8. MAEA生物传感器可同时检测实际食品和临床样品中的两种致病菌。(A) MAEA生物传感器在实际肉类和临床样品中同时检测两种致病菌的过程。（B-C）用MAEA生物传感器测定猪肉样品中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的荧光强度。（D-E）用MAEA生物传感器测定鸡样品中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的荧光强度。(F)在实际肉类样品中通过所提出的MAEA生物传感器和平板计数检测到的致病菌热分析图。（G-H） MAEA生物传感器检测临床样品中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的荧光强度。(1) MAEA生物传感器检测临床样品的准确性。

3. 总结

本研究首次提出了一种磁性Fe₃O₄@MOF@aptamer介导的熵驱动荧光生物传感器，旨在实现多路复用和无DNA提取及扩增的致病菌检测。磁性Zr-MOF作为载体，能够有效分离和富集靶标适配体。研究将CbAgo的精确酶切特性与熵驱动反应的高效等温无酶信号放大结合，从而开发出一种功能强大的多路检测工具，能够同时检测多种致病菌。MAEA生物传感器成功应用于实际食品和临床样品中，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的检测准确度令人满意。该方法具有广泛的适用性，通过替换识别元素，可以定量检测其他细菌。然而，在多路检测的实际应用中，CbAgo可能存在稳定性差和灵敏度低的问题。未来的研究将重点在于利用基因编辑和蛋白质工程技术改进CbAgo的结构，以增强其酶裂解活性，而无需信号放大。此外，MAEA生物传感器应与人工智能技术和微流控芯片相结合，实现智能化、高通量的自动化检测。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.155978