半胱氨酸和半胱氨酸是哺乳动物细胞培养中存在的必需氨基酸。半胱氨酸有助于生物质合成、重组蛋白生产和抗氧化防御机制，但由于其稳定性差和氧化为半胱氨酸二聚体半胱氨酸（Ala-Cys-Cys-Ala，ACCA），在培养基配方中构成了重大挑战。由于胱氨酸的溶解性较差，可导致饲料介质的沉淀，形成不希望的产物，从而降低半胱氨酸的生物利用度。本研究证明了ACCA在改善CHO细胞生长、生产力和代谢方面的潜力，同时也促进了无半胱氨酸和无胱氨酸饲料培养基的配方。这种半胱氨酸和半胱氨酸的替代品将为增强生物制造铺平道路，通过增加培养中的细胞密度和扩大高浓缩饲料培养基的存储，作为实现强化生物生产过程的一部分。

关键发现：

1、 在基础培养基中，用ACCA取代半胱氨酸和半胱氨酸并不支持分批培养中CHO细胞的强劲生长；而在含有半胱氨酸和半胱氨酸的基础培养基中补充ACCA可促进批量培养中CHO细胞的生长和IgG滴度

图1 在基础培养基中用ACCA取代半胱氨酸和半胱氨酸并不能促进分批培养中CHO细胞的生长

图2 在含有半胱氨酸和半胱氨酸的基础培养基中补充ACCA可以提高批量培养中CHO细胞的生长和IgG滴度

首先，实验测试了ACCA是否可以完全取代基础细胞培养基中的半胱氨酸和半胱氨酸。如图2所示，在基础培养基中，用ACCA取代半胱氨酸和半胱氨酸并不支持CHO-GS和CHO-K1细胞在分批培养中的细胞生长。接下来测试了ACCA是否可以用作介质添加剂。在含有半胱氨酸和半胱氨酸的基础培养基中添加了两种不同浓度的ACCA。对照培养物没有添加等效的丙氨酸，因为它作为一种氨基酸的非必要的作用。随着ACCA补充培养基中丙氨酸水平的增加，表明ACCA裂解获得的大部分丙氨酸被分泌到培养基中。总的来说，这些结果表明，虽然用ACCA取代半胱氨酸和半胱氨酸是无效的，但在含有半胱氨酸和半胱氨酸的基础培养基中添加ACCA会导致CHO-GS和CHO-K1细胞系的总体VCD和滴度的增加。

2、 ¹³C代谢通量分析显示，在含有半胱氨酸和半胱氨酸的基础培养基中补充ACCA可以提高CHO-K1细胞的葡萄糖代谢效率

图3 ¹³C代谢通量表明，在添加ACCA的培养基中，CHO细胞的糖代谢效率有所提高。

为了更详细地了解ACCA作用的可能机制，用CHO-K1细胞进行了¹³C代谢通量分析（13C-MFA），因为观察到在该细胞系中补充ACCA有更显著的好处。具体来说，平行标记实验采用CHO-K1细胞在含或不含4 mM ACCA的标准基础培养基中进行。结果表明，补充ACCA提高了CHO-K1细胞的葡萄糖代谢效率，即细胞能够维持较高的生长速率，同时代谢较少的葡萄糖以产生ATP。

3、 ACCA是在高浓度饲料培养基中半胱氨酸和半胱氨酸的良好替代品

图4 ACCA可以在高浓度的饲料培养基中取代半胱氨酸和半胱氨酸，从而提供类似的细胞培养性能

接下来，测试了饲料介质中的半胱氨酸和半胱氨酸是否可以用等量的ACCA所取代。在这些实验中，饲料培养基中含有总浓度为1.76 mM或1.76 mM的ACCA，不含半胱氨酸和半胱氨酸。没有观察到两种饲料培养基对CHO-K1和CHO-GS细胞的细胞培养性能有任何显著差异。结果表明，ACCA可以替代饲料培养基中的半胱氨酸和半胱氨酸，以支持饲料分料过程中CHO-GS和CHO-K1细胞的生长。

结论

在本研究中，评价了一种高可溶性含二肽半胱氨酸二聚体（Ala-Cys-Cys-AlaA，CCA），作为CHO细胞培养中半胱氨酸和胱氨酸的合适替代品。用ACCA取代基础培养基中的半胱氨酸和半胱氨酸并不能维持细胞的生长。然而，在含有半胱氨酸和CHO-K1批培养细胞的基础培养基中添加4 mM和8 mM的ACCA，在CHO-GS和CHO-K1批培养中细胞生长分别达到15%和27%，并导致IgG滴度成比例增加。¹³C代谢通量分析显示，补充ACCA减少了20%的糖酵解通量，导致CHO-K1细胞更有效的糖代谢。在饲料分批培养中，ACCA能够取代饲料培养基中的半胱氨酸和半胱氨酸。此外，在基础培养基中补充高浓度的ACCA消除了饲料培养基中任何半胱氨酸当量的需要，增加了分批培养的细胞密度和活力，而对IgG电荷变异没有任何显著影响。

原文：Ladiwala, P., Cai, X., Naik, H. M., Aliyu, L., Schilling, M., Antoniewicz, M. R., & Betenbaugh, M. J. (2024). Ala-Cys-Cys-Ala dipeptide dimer alleviates problematic cysteine and cystine levels in media formulations and enhances CHO cell growth and metabolism. Metabolic engineering, 85, 105–115. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2024.07.008