星形抗菌肽聚合物载药系统：靶向抑制细菌群体感应，攻克角膜细菌生物膜感染

摘要

与生物膜相关的细菌性角膜炎是一种严重的眼部感染，可导致视力严重受损甚至失明。然而，由于生物膜中的细菌通过群落遗传调控（即细菌法定量感应）抵抗杀菌剂，临床抗生素眼药水的治疗效果往往大打折扣。本文基于“药”中“药”的策略，开发了负载槲皮素（QCT）的星形抗菌肽聚合物（SAPP）QCT@SAPP，用于抑制和根除角膜上的铜绿假单胞菌生物膜。天然抗菌肽模拟SAPP具有带正电荷的两性结构，不仅能使QCT@SAPP轻易穿透生物膜，还能选择性地粘附在带高负电荷的铜绿假单胞菌上，将负载的QCT释放到细菌体内，通过抑制lasI、lasR、rhlR和rhlI来调节法定量感应。得益于SAPP强大的杀菌能力，QCT@SAPP可以消除99.99%以上的生物膜。此外，QCT@SAPP在缓解眼部炎症方面表现突出，它能显著下调促炎细胞因子，并通过释放QCT清除活性氧，最终帮助恢复视觉功能。总之，QCT@SAPP具有良好的兼容性，能在细菌性角膜炎小鼠模型中发挥出色的治疗效果，因此有望成为控制细菌生物膜诱导的感染的候选药物。

研究背景与挑战

细菌性角膜炎是一种快速进展的局部角膜感染，伴有细菌入侵、炎症反应和眼表破坏，对公共视力健康构成重大威胁。绿脓杆菌引起的角膜炎因其强侵袭性而备受关注，若未得到及时妥善治疗，可能导致严重角膜溃疡、新生血管化和最终瘢痕形成，进而引发角膜失明。然而，目前的治疗手段如抗生素眼药水，由于眼表生物膜的保护作用和细菌固有的耐药性，治疗效果大打折扣。

生物膜是细菌形成的一种高度结构化的胞外聚合物基质（EPS）丰富的群体，其微环境可作为保护屏障，使细菌在恶劣环境中生存，包括对抗生素的暴露。这导致了药物抗性和复发性感染的主要驱动因素。因此，开发更有效的抗生物膜治疗手段，具有良好的生物相容性和低药物抗性，对于治疗与生物膜相关的细菌性角膜炎至关重要。

研究成果与创新

本研究中，研究人员开发了一种名为QCT@SAPP的新型纳米复合物，通过将天然抗菌肽模拟的星形抗菌肽聚合物（SAPP）与槲皮素（QCT）结合，实现了对绿脓杆菌生物膜的有效抑制和清除。SAPP具有正电荷两亲性结构，不仅能够使QCT@SAPP轻松穿透生物膜，还能选择性地粘附在高度负电荷的绿脓杆菌上，将负载的QCT释放到细菌中，通过抑制lasI、lasR、rhlR和rhlI基因来调控群体感应。得益于SAPP的强大杀菌能力，QCT@SAPP能够消除超过99.99%的生物膜。

此外，QCT@SAPP在缓解眼部炎症方面表现出色，通过显著下调促炎细胞因子并利用释放的QCT清除活性氧物种，最终有助于恢复视觉功能。在细菌性角膜炎小鼠模型中，QCT@SAPP展现出良好的相容性和卓越的治疗效果，使其成为控制细菌生物膜引起的感染，包括细菌性角膜炎的有前景的候选药物。

技术细节与实验验证

QCT@SAPP的制备基于“药中之药”策略，首先通过N-羧酸酐开环聚合反应合成了具有正电荷两亲性结构的SAPP，然后将QCT物理封装在SAPP的疏水空腔中，以提高其水溶性和生物利用度。实验结果显示，QCT@SAPP在中性环境（pH 7.4）中相对稳定，而在酸性环境（pH 6.0）中QCT释放迅速，这表明QCT@SAPP更有可能在眼部感染发生的酸性环境中释放QCT。

图1. QCT@SAPP的示意图和表征。

在生物膜穿透和细菌粘附实验中，QCT@SAPP能够有效穿透绿脓杆菌生物膜，并在生物膜内均匀分布。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和高分辨率结构诱导照明显微镜（HIS-SIM）观察到，QCT@SAPP与绿脓杆菌的共定位，证实了其快速穿透和选择性进入细菌的能力。

图2. QCT@SAPP可渗透生物膜并附着在细菌上，发挥抑制群体感应的作用。

在群体感应抑制实验中，QCT@SAPP显著降低了绿脓杆菌生物膜中多种群体感应信号分子的含量，包括C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL和3-OXOC12-HSL，抑制率分别超过93.2%、95.2%、70.0%和77.1%。这表明QCT@SAPP能够有效抑制细菌群体感应信号分子的产生，从而抑制细菌群体感应。此外，QCT@SAPP还显著降低了细菌的毒力因子，如生物量、绿脓菌素、紫色素和EPS，这有助于减少绿脓杆菌对正常细胞和组织的侵袭能力。

图3.QCT@SAPP在体外造成的细菌膜破裂和生物膜破坏。

在细菌膜破裂实验中，QCT@SAPP通过电泳作用在细菌膜表面聚集，并诱导膜溶解，发挥杀菌活性。冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）观察到，经QCT@SAPP处理后，细菌膜出现破裂和裂缝，最终导致细菌细胞破裂，内容物泄漏。

在体外抗生物膜评估中，QCT@SAPP展现出卓越的抗生物膜能力，能够在低浓度下显著减少细菌菌落，与QCT单独处理相比，QCT@SAPP处理组的细菌菌落数减少了99.996%。此外，QCT@SAPP处理后的生物膜厚度显著减少，与对照组相比减少了80.3%。

图4.QCT@SAPP 治疗后的体内生物膜追踪和角膜结构评估。

临床应用前景与结论

在这项研究中，基于以药递药策略，制备了携带群体感应抑制剂的星形抗菌多肽，命名为QCT@SAPP。带正电荷的QCT@SAPP 选择性地粘附在带负电荷的细菌膜上并穿透生物膜。特别是，其特定的膜粘附和破坏特性导致最小的耐药性，以发挥强大的杀菌作用以消除生物膜。一旦 QCT@SAPP 在细菌膜上聚集，QCT 就会在细菌内部持续释放，从而有效调节lasI、lasR、rhlR、和rhlI的表达，并抑制生物膜的群体感应。细菌交流的中断大大减少了细菌的毒性，促进了生物膜的逐渐分解，并进一步促进了QCT@SAPP随后的生物膜进入。同时，吸附在细菌膜上的QCT@SAPP增加会诱导膜裂解和细菌死亡。更有吸引力的是，QCT@SAPP还通过下调炎症细胞因子，有效减轻了角膜炎症反应，避免了进一步的角膜组织损伤。这对于防止白斑和其他潜在的视力损害后遗症的形成至关重要。在绿脓杆菌感染的角膜炎小鼠模型中，证实了QCT@SAPP局部滴眼液在体内抗击细菌性角膜炎的强大功效。此外，角膜炎症反应也大大降低，避免了对角膜组织的进一步损伤。

综上所述，QCT@SAPP作为一种新型的纳米复合物，通过抑制细菌群体感应和破坏细菌膜，有效清除了角膜上的细菌生物膜，并显著减轻了眼部炎症，恢复了视觉功能。这一研究成果不仅为治疗细菌性角膜炎提供了新的策略，也为开发新型抗生物膜药物提供了重要的科学依据。未来，随着进一步的临床研究和应用，QCT@SAPP有望成为治疗细菌性角膜炎和其他生物膜相关感染的有力武器。

参考文献：Zhouyu Lu, Wenjie Fan, Yang Ye, Yue Huang, Xianchi Zhou, Yin Zhang, Wenyu Cui, Jian Ji, Ke Yao, and Haijie Han, DruginDrug:QuorumSensingInhibitor in Star-ShapedAntibacterialPolypeptidesfor InhibitingandEradicatingCornealBacterial Biofilms, ACS Nano.DOI: 10.1021/acsnano.4c12195

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.4c12195