败血症是由感染引发的全身性炎症反应综合征，可进一步发展为感染性休克，是全球主要的死亡原因之一。每年全球有超过4000万人受到败血症的影响，其死亡率高达20-50%，给公共卫生带来了沉重的负担。对于败血症患者而言，及时给予适当的抗生素治疗至关重要，能够显著提高患者的生存率和预后。然而，传统的临床AST方法包括血液培养、纯培养、物种鉴定和AST等多个步骤，通常需要2-3天TAT。漫长的流程使得临床医生不得不依赖经验性、广谱抗生素治疗方案，这极可能延误患者的治疗时机，增加死亡风险，还可能引发抗生素耐药性的发展，造成不必要的医疗资源浪费。尽管已有一些先进的方案，但它们普遍存在以下问题：①灵敏度较低，仍然依赖于阳性血液培养物；②在样本处理过程中，感染病原可能会丢失；③分子检测技术的应用壁垒：表型和基因型之间的不对等关系。基于此背景，韩国首尔国立大学Tae Hyun Kim、Junwon Kang和Haewook Jang等人开发了一种具有创新性和临床应用潜力的超快速AST方法（uRAST），通过结合病原体分离（β2GPI肽修饰的纳米粒子）、快速鉴定（QmapID）和低接种量表型AST评估（高分辨率显微呈像）等技术，实现了从全血样本到药物敏感性结果的快速、准确转化（图1）。

相对于其它研究中常用的具备高度特异性的抗体或适配体，本研究采用合成的β2GPI肽（sβ2GPI）修饰的纳米粒子实现样本中病原菌的选择性但广谱性的分离，以避免样本中未知感染病原的遗漏。简单说来，实验时，将sβ2GPI修饰的纳米粒子注入含有细菌的全血样本中，孵育30分钟后纳米粒子与细菌结合，形成稳定的纳米粒子-细菌复合物，然后利用磁性分离技术，将结合有细菌的纳米粒子从血液样本中分离出来，去除血细胞和其他成分。分离得到的细菌重悬于新鲜培养基中，以便进行后续的物种鉴定和药物敏感性测试。在这里，所使用的sβ2GPI纳米粒子在高细菌负荷和低细菌负荷（1-10 CFU/mL）条件下均能实现病原的高效捕获，且以4 CFU/mL为最低检测限，显示出了良好的低丰度检测能力。同时，富集过程中白细胞和红细胞的去除率分别高达99.90%和99.99%。另外，利用不同种类的临床分离株证明了sβ2GPI的广谱性捕获能力（图2）。针对病原鉴定，作者建立了QmapID系统，此系统的工作原理主要基于形状编码微盘和特异性DNA探针的结合，通过荧光标记和成像分析实现对病原体的快速检测和多重鉴定。在这里，利用预先提取的36份临床分离株的gDNA验证了本方法的特异性和灵敏度（10 个病原/反应）。尽管阴沟肠杆菌与大肠杆菌有交叉污染的可能，但是作者认为这在多重检测时可以得到综合。另外，在利用葡萄球菌探针检测时，缓慢葡萄球菌也会出现遗漏的情况。但总的来说，联合前期的样本处理，本方法的灵敏度及荧光强度都得到了很大的提升（图3）。进一步，作者将分离的病原引入低输入96孔AST芯片进行药敏分析。在这里，作者引入了一个“快速培养”的概念，即将分离到的病原用新鲜培养基培养而非血培养，此操作可有效促进细菌增殖并缩短周期。此外，低输入的细菌量在相等的时间内细菌的扩张面积更大，更有利于最终结果的观察。另外，作者分别利用20例和15例大肠杆菌和金黄色葡萄球菌临床分离株验证了uRAST的应用可行性。相较于BMD，uRAST能够在12 h内获得高度一致的MIC值（图4）。不过，对于uRAST，测定金黄色葡萄球菌对青霉素的MIC值远远偏高，这极可能是因为接种量导致的：低接种量下细菌产生的耐药因子浓度较高，导致MIC值偏高。最后，作者引入190例恶性血液病和疑似感染的住院患者对本研究的实际临床应用价值进行了评价，其中16例因转移导致的延迟而被排除在外。相对于标准的培养-染色-鉴定流程，QmapID对临床样本中的病原鉴定准确性为100%，TAT缩短13.11 ± 6.16 h（P = 0.0034）。针对鉴定的6种病原：2株粪肠球菌，1株大肠杆菌，3株肺炎克雷伯菌，作者再次将其混入全血（5 CFU/mL）中并按照图4（a）流程重新处理。相较于BMD，uRAST的总体分类一致性为94.9%（93/98），次级错误为5.1%（5/98），基本一致性为94.4%（34/36）。此结果满足美国FDA对AST的要求。另外，作者还引入了商用设备VITEK2和Phoenix M50的比较。结果显示，uRAST的分类一致性还相对较高。更重要的是，与临床AST方案相比，uRAST显著改善了TAT（47.99±9.69 h）；倘若所有uRAST程序都完全自动化，并排除了由实验室有限的AST实践时间（非技术性）造成的工作时间延迟，TAT将进一步缩短（62.99 ± 15.44 h，P = 0.0002）。另外，为了强调及时AST的紧迫性和重要性，研究对在检测期间死亡的一名患者（P. 126）进行了案例研究。该患者患有自然杀伤/T细胞淋巴瘤，在接受持续性化疗12天后，开始发热，然后采用美罗培南进行经验治疗。在不知道致病原情况下，考虑真菌感染，立即连续用药。一天后，病情加重，并导致急性肾损伤。此后第二天，病原鉴定和药敏结果告知感染病原是肺炎克雷伯菌，且对碳青霉烯类抗生素表现耐药，治疗立即转向粘菌素和阿米卡星。然而，由于血压不稳定和健康状况恶化，患者被转到重症监护病房。尽管接受了重症护理，病人还是在后二天死亡。在此治疗期间，倘若应用本研究的uRAST方案，可在肾功能衰竭发生前给予最佳抗生素治疗，由此降低疾病的严重程度（图5）。

总的来说，本文章开发了一种无需传统血培养的AST平台，不同于其它“快速”表型AST，本研究直接从全血中进行AST以从根源上缩短试验周期，并可能在菌血症被证明之前就能提供精确的药敏结果。这不仅可以缩短诊断时间，使临床医生能够及时调整治疗方案，提高患者的生存率和预后，还能减少不必要的抗生素使用，延缓抗生素耐药性的发展。通过未来验证更多样化的患者验证其疗效和临床价值，以及努力降低成本通过大规模生产和系统自动化来减轻造成的实质性（非技术但主导）延迟实验室工作时间，此方法或将完全改变当前标准的菌血症诊断和带来新的关注下一代无培养AST平台的发展。

图1  uRAST的设计目标（a）、工作流程（b-g）及优势（f）。首先利用β2GPI肽修饰的纳米粒子实现全血样本中病原的高效分离，去除白细胞、红细胞、抗生素等干扰成分（b）。针对分离得到的病原，部分引入QmapID系统进行病原鉴定（c），部分引入纯培养基进行快速增殖（d）及后续的低接种量AST分析（g）。（f）相对于其它商业化AST技术（如Microscan、VITEK2、Phoenix等），uRAST在缩短TAT和提高测试准确性方面具备显著性优势。

图2 （a）合成的β2GPI肽修饰的纳米粒子的结构和功能。（b）全血样本中病原体分离流程的时间线和工作流程。（c-d）PBS和血液样本中低细菌负荷（1-10 CFU/mL）下大肠杆菌（c）和金黄色葡萄球菌（d）的捕获效率表征。（e）病原富集过程中红细胞和白细胞的去除效率。（f）针对血液中常见但不同的革兰氏阳性菌和阴性菌的捕获率，均为血液样本中的临床分离物。（g）检测限的重复性测试。

图3 （a）QmapID的检测流程。（b）图像处理算法。（c-e）实验结果分析。（c）QmapID针对多种临床分离株的荧光检测强度，特异性结果展示。（d）基于不同样本前处理方法的QmapID灵敏度展示。（e）明场和荧光的合成图及对应的荧光强度图谱。所得到的图像代表了三个独立的实验。

图4  基于96孔低输入AST芯片的设计与表征。（a）将从血液样本里分离出来的病原菌与琼脂混合并加载入96孔AST芯片中。（b-f）大肠杆菌（b，e）和金黄色葡萄球菌（c，f）在新鲜培养基和标准血液培养瓶中的生长速率比较及接种量的影响评价。（d）96孔AST芯片中单孔示意图。（g-h）uRAST（12 h）与BMD（18 h）针对大肠杆菌（g）和金黄色葡萄球菌（h）的MIC值比较。

图5  使用QmapID和uRAST对疑似感染患者的临床研究。（a）患者的分布类型及感染情况。（b）uRAST结果与BMD检验结果的分类一致性和误差。ME，主要错误；mE，小错误。（c）BMD和uRAST之间的MIC比较及基本一致性计算。阴影区域表示药物的基本一致性范围。（d）uRAST和临床AST耗费周期的比较。TAT是从血液处理的开始就计算出来的。工作时间延迟相当于在医院实验室进行常规AST的工作时间有限（夜班期间缺乏微生物学工作人员）。（e）医院AST方法与uRAST的TAT比较（患者P.126）。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-07725-1