抗生素的过度使用导致全球抗生素耐药性（AMR）的增加，严重危害人类健康福祉。多重耐药（MDR）细菌在医疗环境中普遍存在，导致难以治疗的感染和较高的死亡率。快速识别和测定抗生素耐药性是临床微生物学中的关键任务，对于优化感染病的管理和减少广谱抗生素的使用至关重要。当前的金标准AST方法包括基于液体培养基的微量肉汤稀释法（BMD）和基于固体培养基的纸片扩散法或E-test。这些方法通过评估细菌在抗生素存在下的整体行为，以提供最小抑菌浓度（MIC）或者抑菌圈直径，从而确定细菌对抗生素的敏感性或耐药性。该方法主要面临2个挑战：（1）检测周期长，通常需要2-4天，这往往会延迟最佳治疗方案，促使经验性广谱抗生素治疗方案。（2）无法区分细菌的表型异质性，以此导致假阳性或假阴性结果。BMD通过测定细菌的浊度实现MIC值界定，然而，浊度测量不仅取决于细胞数量，还受到细胞大小和形态的影响。当细菌暴露于抗生素时，其形态可能会发生改变（如细胞膨胀、变长或形成丝状结构），这些变化会增加溶液的浊度，即使细胞数量没有显著增加，也会导致OD值的增加，从而产生假阳性结果。另外，细菌群体中存在不同的亚群，群体效应可能会掩盖个体效应而导致出现假阴性结果。针对上述挑战，基于液滴微流控的单细胞AST技术显示出了极佳的优势，通过将单个细菌封装在滴液中，可加速其增殖和反应，并快速诊断异质耐药性。已有的一些先进方案通过光学成像观察细菌在抗生素暴露后的形态变化（如细胞分裂、膨胀和丝状形成）来确定抗生素敏感性，耗时4小时。不过这些技术通常需要高分辨率显微镜持续观察及细菌固定技术，如琼脂糖凝胶固定、介电电泳辅助捕获、限制性微通道和纳升孔等。另外，基于微流控技术和电学阻抗测量的单细胞分析技术也是一种开创性技术，可以在1小时内使用活跃分裂的培养样本确定AST结果。然而，这些方法通常涉及复杂的读出系统，依赖于特定的电化学或荧光标签，以及复杂的检测系统，且尚未实现对不同抗生素浓度的多重检测格式。基于此背景，Jae Seong Kim等人开发了一种基于液滴微流控的单细胞无标记AST分析平台，其设计原理概括如下：（1）通过控制流道宽度形成浓度梯度的抗生素溶液。不同宽度的流道设计使得抗生素溶液和细菌悬液在微流控通道中混合，形成预定的浓度梯度。（2）利用8个并行的流动聚焦液滴生成装置将不同浓度的抗生素溶液及细菌悬液封装在液滴中，每个液滴中的细菌数目在1-4个，确保单细胞水平的分析。（3）将液滴置于37°C下孵育，观察细菌在不同浓度抗生素下的生长情况。通过时间序列成像，记录细菌数量的变化。（4）利用图像分析软件对时间序列图像中的细菌数目进行自动计数，软件会识别细菌细胞并计算其数量，绘制生长曲线。（5）MIC值界定。界定标准：在特定时间内，细菌数量的增加不超过2.0倍的抗生素浓度（图1）。

首先，作者利用大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）验证了方法的可行性，显示了方法具备显著缩短实验周期的能力（3 h）。然后，利用10株临床分离株（包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA和多重耐药金黄色葡萄球菌MDRSA）对方法的临床应用价值进行了评价，测定的结果与BMD获得的MIC值高度一致，准确率高达94.5%，这表明该平台在临床样本中的应用具有高度的准确性和可靠性。值得关注的是，作者展示了平台区分细菌亚群的能力，而非简单地确定细菌对液滴中的抗生素产生耐药性的速度。为总结整个实验中细菌的生长情况，作者将细菌的生长模式分为下列三种：（1）活跃生长：细菌数目增加4个或更多；（2）缓慢生长：细菌数目增加1到4个；（3）抑制生长：细菌数目增加1个或更少（图2A）。作为例证，作者首先研究了S. aureus NCTC 8325-4在几种抗生素暴露下的生长模式（图2B）。结果显示，在没有抗生素暴露的情况下，细菌的生长模式都是100%活跃的。然而，在抗生素暴露时，液滴中的细菌对不同浓度的抗生素展现出来了不同的生长模式。例如，在较低浓度的苯唑西林（≤0.29 μg/mL）暴露处理下，相当数量的细胞显示出了活跃生长，显示出了亚MIC水平的耐受性。随着浓度增加，活跃生长的细菌百分比急剧下降。尤其是当浓度≥0.35 μg/mL，生长活跃状态的细胞比例下降到约10%，其余2种状态的细菌数目增高。不过值得关注的是，即使在较高的苯唑西林浓度（范围从0.48到0.61 μg/mL），一小部分细菌（低于3%）仍然表现出活性生长。同时，液滴中缓慢生长的发生率从3%到45%不等，随着苯唑西林浓度的增加而增加。这一现象证实了S. aureus种群中抗生素敏感性的异质性（表型异质性）。另外，作者还扩展研究了S. aureus对括环丙沙星、庆大霉素和万古霉素的异质性。通过揭示细菌对不同抗菌药物反应的不同生长模式，作者发现：即使抗生素处理浓度在超过MIC阈值时，表现出活跃生长的细菌比例显著下降，但仍有一部分的细菌种群表现出了缓慢生长，而这种生长模式有助于AMR的发展。此结果强调了细菌适应的复杂性，并强调了在AMR背景下理解这些动态的关键重要性。为了证明方法的适用性，作者进一步展示了10株临床分离株（MRSA和MDRSA）对苯唑西林、环丙沙星、庆大霉素、利奈唑胺和万古霉素的异质性（图2 C-D）：在测试抗生素的MIC浓度以上表现出了一定比例的活跃和缓慢生长。而这一个信息是传统的BMD检测技术未能提供的，所导致的异质性菌群信息的遗漏极可能导致治疗失败，由此突出了本研究方法的重要性。

总的来说，本研究发展的基于液滴的无标记单细胞AST，通过集成浓度梯度抗生素形成模块，液滴生成模块，时间序列成像及分析模块，可以在3 h内告知目标菌的MIC值及表型异质性。通过在单细胞水平上揭示细菌表型异质性，识别出不同生长模式的细胞，可以针对性定制个性化治疗方案，有助于实现精准医疗。另外，本研究通过时间序列成像来观测细菌生长情况，免除了刃天青等荧光标记物的存在，避免了体系的泄露或串扰情况。尽管研究展示了一定的优势性，不过研究对其它病原菌和抗生素的扩展性还有待研究。另外，研究的出发点仍然是基于纯培养物的，尚未真正应用到实际样本，未来或可在这方面精进发展。

图1 基于液滴微流控的无标记单细胞AST的设计流程。

图2  （A）液滴中细菌的表型异质性。（B）3小时内S. aureus NCTC 8325-4在不同抗生素暴露处理下的生长模式。（B）MRSA临床分离株的表型异质性。（C）MDRSA临床分离株的表型异质性。

原文DOI: 10.1039/d4lc00629a