工程化M13噬菌体用于暗场成像快速检测大肠杆菌

图 1：快速自动化和精确的基于可视化的平台用于快速检测大肠杆菌

大肠杆菌（Escherichia coli）是最常见的肠道食源性病原菌之一，其监测对于食品安全和环境保护至关重要。然而，传统检测方法如培养法、酶联免疫吸附实验（ELISA）和聚合酶链式反应（PCR）存在显著局限性，包括耗时长、设备昂贵以及对操作条件要求高。因此，开发高效、快速的大肠杆菌检测技术成为当前研究的重点。暗场显微镜因其操作便捷、速度快以及对环境条件要求较低的优势，在生物分析领域得到了广泛应用。然而，针对特定病原体的分离与检测通常需要抗体，这增加了检测的时间和成本。近年来，噬菌体作为替代抗体的工具受到关注。噬菌体能够通过其受体结合蛋白（RBP）特异性识别病原菌，并因其生产成本低、稳定性高而成为一种理想的生物探针。其中，M13噬菌体因其对大肠杆菌具有高亲和性，以及其结构稳定、可通过噬菌体展示技术进行功能化改造，被广泛应用于传感和检测领域。然而，野生型M13噬菌体的细长丝状结构（长约880 nm，直径仅6 nm）容易在高浓度使用时发生缠结，导致结合位点暴露不足和结合效率降低。通过对M13噬菌体基因组的操作，可实现其长度的调控，开发截短型M13（tM13）噬菌体。进一步的研究表明，适度截短的M13噬菌体不仅可减小缠结风险，还能保持其柔性和捕获能力。然而，如何优化其结构特性，以提高其在复杂样本中对目标病原体的特异性分离和检测效率，仍然是一个挑战。

此外，传统M13噬菌体依赖F型菌毛与大肠杆菌结合，这限制了其检测范围。本研究通过在M13噬菌体pIII蛋白N端引入特定突变，增强其对TolA受体的结合能力，从而扩大了其对不同大肠杆菌菌株的适用性。同时，为了实现tM13的高效分离，如图2所示本研究利用化学修饰技术，将生物素分子引入pVIII蛋白，通过链霉亲和素磁珠进行目标细菌的分离。结合暗场显微镜与卷积神经网络（CNN）图像处理技术，本研究提出了一种新型的大肠杆菌检测策略。该方法利用暗场显微镜对细菌进行成像，并通过深度学习技术自动识别目标病原体，克服复杂背景的干扰，为食品与环境样本中大肠杆菌的快速、灵敏检测提供了技术支持。

图2：使用 tM13 和智能暗场成像平台快速检测大肠杆菌的示意图。使用野生 M13 制备 tM13 颗粒，并通过生物素功能化生成 tM13-生物素。使用 tM13-生物素颗粒捕获目标大肠杆菌后，可以使用链霉亲和素包被的磁珠利用磁力快速分离目标大肠杆菌。然后从磁珠中洗脱细菌的兴趣，并使用人工智能算法进行暗场显微镜计数。

基于对M13噬菌体基因组复制机制的研究，作者发现敲除M13KO7基因组中的复制起始区几乎完全阻止其自我包装，但由于携带P15A质粒复制子，仍能以质粒形式在宿主细菌中稳定存在并表达蛋白。参考Specthrie等人的工作，作者开发了一种双质粒系统生产截短型M13（tM13）噬菌体。该系统中一个质粒（pUC-tM13）以pUC19为载体，包含f1 ori和f1term等元件，促进单链DNA的生成，并携带优化DNA运输的信号序列（PS）和复制增强因子Domain B；另一个质粒基于M13KO7的蓝图进行改造，携带抗性基因和P15A复制子，但删除了单链复制区和包装信号序列，仅表达包装蛋白。通过验证，发现单独转化pUC-tM13或KO7Δori无法生成圆化tM13基因组，而联合转化可成功生成目标tM13。SDS-PAGE和Western blot检测确认了主要衣壳蛋白的存在。接着，作者在pUC-tM13质粒中插入pIII序列并构建了不含表达元件的对照载体，透射电子显微镜显示，插入pIII显著增加了噬菌体长度，并提高了产量，且pUC-tM13::pIII的长度更加均匀，适合后续应用。为了优化tM13的修饰与显示，作者通过点突变将pVIII氨基末端的Val30替换为半胱氨酸（Cys），使外周pVIII暴露巯基，成功将BMCC-生物素连接到修饰后的tM13上。通过与链霉亲和素磁珠结合，实验结果显示修饰后的tM13与磁珠的结合能力显著增强，且在细菌吸附和磁分离效率方面，tM13-Biotin优于未修饰的tM13以及M13KE-Biotin。这些研究表明，tM13的截短长度优化和生物素修饰显著提升了其在细菌分离与检测中的应用潜力。

图 3：用暗场显微镜表征从MNP@SA洗脱的不同浓度的细菌细胞，以及暗场显微镜计数和传统平板计数方法（比例尺，30 μm）的校准曲线的比较。（i） 至 （iii） 展示了三种不同浓度的大肠杆菌的暗 f ield 显微镜特征。分别使用 tM13 探针联合智能 DF 测定。B-H 分别说明了该方法与传统平板计数法对已知理论浓度的 ER2738 （A）、Trans1-T1 （C）、O157：H7 （E） 和 PAO1 （G） 的定量比较曲线。

该研究同时探讨了优化截短型M13噬菌体（tM13）在靶向大肠杆菌检测中的能力。作者集中在对pIII蛋白在pUC-tM13::pIII和KO7Δori-Cys株系中的两种修改，包括将第153位的甘氨酸（G153D）突变为天冬氨酸，以及删除N2结构域，这些修改激活了pIII并暴露了大肠杆菌表面主要受体TolA的结合位点，旨在提高噬菌体在大肠杆菌中的感染效率。结果显示，G153D突变增强了M13噬菌体对F-型大肠杆菌的结合效率，尽管噬菌体产量轻微下降，但仍足够用于应用。三种tM13变体的夹心ELISA实验结果表明，G153D突变对大肠杆菌的结合最有效，而tM13-pIIIΔN2则表现出对F-大肠杆菌Trans1-T1的最佳结合亲和力。在磁分离实验中，tM13-pIIIG153D在E. coli ER2738中的分离效率高达94.6%。修改后的tM13变体对致病性大肠杆菌O157:H7和铜绿假单胞菌PAO1的结合和分离能力较低，表明其对靶菌具有较高的特异性。通过暗场显微镜检测和量化细菌细胞，结果显示tM13-pIIIG153D能够高效捕获并计数大肠杆菌细胞。虽然与传统的平板计数方法相比，量化精度存在一些挑战，特别是对于非靶菌株，但研究者通过开发一个图像处理模型，利用卷积神经网络（CNN）分析暗场显微镜图像，获得了优于传统软件如ImageJ的精度和召回率，二元分类任务的准确率达到了97.4%。尽管还需进一步优化，这项研究表明，tM13-pIIIG153D在大肠杆菌检测中作为一种成本效益高、效率好的替代品具有相当大的潜力。噬菌体的特异性与先进的图像处理技术结合，为未来的病原检测提供了新的发展方向，未来的研究应集中在改进预处理方法、将多种菌株纳入训练数据集，以及使用外部数据集测试模型的普适性。

本研究提出了一种创新的检测平台，结合了通过磁性分离鉴定生物素化截短型M13噬菌体（tM13）和基于AI的暗场显微镜系统，用于快速、精确地检测大肠杆菌。经过pIII N末端域修饰的tM13噬菌体能够高效结合多种大肠杆菌株（如ER2738、Trans1-T1、O157:H7等）。生物素化tM13可以通过结合有链霉亲和素（SA）功能化磁性纳米颗粒（MNPs）快速分离。由于大肠杆菌在暗场照明下具有独特的结构特征，分离后的细菌细胞可通过AI技术在暗场显微镜下自动识别和计数。基于tM13的AI策略使得检测大肠杆菌实现了快速（30分钟内）和高灵敏度（检测下限为10 CFU/μL）。考虑到噬菌体的多样性和其对宿主细菌的特异性，理论上，这种基于tM13的AI方法可以扩展到其他噬菌体种类，用于快速、敏感地检测其宿主细菌。

原文doi ：https://doi. org/10.1186/s12951-024-02881-y