1. 引言

20世纪初，β-内酰胺抗生素的发现及其发展标志着人类医学的重大进步，使得传染病得以广泛治疗。β-内酰胺类通过与青霉素结合蛋白（PBPs）结合，抑制细菌细胞壁的生物合成。然而，细菌对这些抗生素的耐药性迅速发展，成为临床应用中的持续挑战。革兰氏阳性菌的耐药机制主要包括替代PBP的表达，而革兰氏阴性菌则通过减少运输蛋白或产生外排泵来逃避抗药性，其中β-内酰胺酶的产生是最普遍且临床意义重大的耐药机制。自1929年青霉素被发现以来，随着新型β-内酰胺类药物的发展，超过4900种天然存在的β-内酰胺酶已被记录。β-内酰胺酶可根据Ambler系统和Bush-Jacoby功能分类系统进行分类，这些分类有助于理解耐药机制及其临床影响。近年来，基于分子印迹技术的蛋白质识别技术迅速发展，以提高对靶蛋白的选择性和识别性能。表位印迹技术尤其受到关注，因为它能通过小肽模板制备印迹材料，从而提高了结合位点的均匀性和识别效率。

本研究选择最常见的shv型β-内酰胺酶作为靶蛋白。SHV是一个具有代表性的β-内酰胺酶家族，包括240多种具有不同水解谱的酶（http://www.bldb.eu/）。首先，利用与生物信息学工具相关的数据库，采用基于计算机的方法精确鉴定shv特异性表位。然后，以确定的表位为模板，以亚微米Fe3O4颗粒为底物，采用表面印迹技术制备了SHV特异性磁表位印迹凝胶聚合物（MEI-GP），该聚合物可以基于表位特异性识别选择性吸附SHV。最后，根据制备的MEI-GP，建立样品提取程序，选择性地从革兰氏阴性菌中提取SHV，然后提交MALDI-TOF MS进行特异性测定。

图1. SHV-1的示意图，其中突出显示了信号肽，活性位点，二硫键结构域和shv特异性表位。B SHV-1的一级序列，由286个氨基酸组成，重要的位点和结构域用不同的颜色标记。C SHV-1的三维结构，由PyMOL生成，其中shv特异性表位用蓝色标记

2. 结果与讨论

MEI-GP的制备及识别机理

通过可控溶剂热法合成Fe₃O₄颗粒，以确保其粒径适合蛋白质的吸附需求（约5-10纳米）。在合成过程中，调节Fe³⁺浓度和聚乙烯醇（PEG）用量以控制Fe₃O₄的粒径和磁饱和值。为提高Fe₃O₄的水溶性，团队对其进行了聚丙烯酸（PAA）改性，利用PAA链上的羧基与铁阳离子形成坚固涂层，从而增强颗粒在水中的分散性。随后，研究者对Fe₃O₄颗粒进行了二氧化硅（SiO₂）涂层的优化，调整了TEOS用量、反应时间和氨水体积，以获得合适的SiO₂膜厚度。最终，在特定条件下成功制备了单分散的Fe₃O₄@SiO₂颗粒，并为后续的印迹聚合提供了良好的基础。在印迹聚合过程中，采用无催化剂的溶胶-凝胶法，以三种硅烷偶联剂为功能单体，形成一个富含功能单体的区域。

图2. SHV特异性MEI-GP制备及其对SHV的吸附机理示意图。shv特异性表位的分子结构及其与功能单体的非共价相互作用在虚线框中显示

通过固定功能单体和交联剂的用量，调整模板表位的摩尔比，以优化表位印迹聚合物的制备。结果显示，随着模板剂量的增加，材料的吸附量逐渐减少，低剂量模板导致非特异性吸附，而高剂量模板则因聚合物交联而捕获了许多印迹空腔。最终确定的最佳摩尔比为1:(5.8):(9.4):(3.4):(20.4)，在此条件下，材料的吸附量保持稳定。此外，研究指出，非印迹聚合物的制备需要氨水催化，其影响遵循抛物线模式。通过溶胶-凝胶聚合法制备的MEI-GP和mini-gp均为单核核壳结构，印迹膜和非印迹膜的厚度均为2-4纳米。

MEI-GP的模板表位识别机制，涉及静电吸引和氢键等非共价相互作用，这些相互作用发生在印迹腔中。模板VDAGDEQLER具有良好的水溶性，能在极性溶剂中轻易溶解，但在低极性液体中不易溶解。为此，研究选用乙醇/1,2-丙二醇（1:1, v/v）混合溶剂作为孔隙剂，并采用乙醇/水（1:1, v/v）进行模板吸附，以有效表达非共价相互作用。在吸附之前，需将SHV蛋白变性为可溶的线性结构，以确保表位完全暴露。研究中通过加入2%（w/v）的SDS并在100℃下加热10分钟，使变性后的SHV被阴离子包裹并溶于水。由于乙醇具有强沉淀能力，最终选择1,2-丙二醇/水（1:1, v/v）作为介质来吸附SHV。

图3. 制备的四种磁性材料的透射电镜图像。比例尺和膜厚以红色标示

特征

研究团队制备了四种近球形的材料，尺寸分布较窄（340±20 nm），在水溶液中表现出良好的单分散性。Fe₃O₄微球由多个小颗粒组成，具有多晶性质，而其余三种材料为单核核壳结构，壳厚度均小于10 nm。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析显示，Fe₃O₄表面存在-COOH基团，其他三种材料则在1095 cm−1处出现Si-O-Si拉伸振动峰。

X射线光电子能谱（XPS）结果表明，Fe₃O₄-COOH的O 1s和C 1s峰清晰可见，而MEI-GP和MNI-GP的C 1s峰明显升高，证实了官能团的成功修饰。X射线衍射（XRD）谱图显示所有材料的衍射峰与立方反尖晶石Fe₃O₄特征一致，表明其结晶度稳定。磁化曲线分析显示，这些材料表现出典型的超顺磁性，MEI-GP的饱和磁化强度为52.9 emu/g，表明其在外加磁场下易于分离。

图4. 4种磁性材料的FT-IR光谱、B XPS调查、C XRD分析和D磁化曲线

MEI-GP对模板表位和重组SHV的吸附行为

MEI-GP的模板表位识别机制，发现其吸附行为符合Langmuir模型，表明结合位点均匀分布。MEI-GP相较于MNI-GP显示出更高的吸附量和亲和力，印迹因子也显示出MEI-GP的优势。Sips模型则适用于SHV（变性）吸附，表明在单层吸附后，SHV分子与游离SHV分子之间发生范德华相互作用。

通过选择性实验，MEI-GP对模板表位的吸附量显著高于参考肽，证明了其特异性识别机制。MEI-GP对SHV的选择性优于对参比蛋白，显示其能够从复杂基质中有效纯化靶蛋白。吸附动力学研究表明，MEI-GP对模板表位的吸附速度很快，仅需2分钟达到平衡，而SHV-1的吸附速率较慢，需近30分钟才能达到初始平衡。

伪二阶模型很好地拟合了两条动力学曲线，表明吸附主要是由化学吸附控制，这与非共价相互作用和表位特异性识别有关。

图5. A， B MEI-GP和MNI-GP与模板表位（SHV特异性表位）和重组SHV的结合等温线，以tem特异性表位和重组TEM-1为参比分子。吸附前，球形蛋白分子（SHV和TEM-1）变性为线性结构。目标分析物吸附的C-E拟合曲线。最匹配的模型被标记为一个复选框（在折线框中看到）。F， G模板表位和重组SHV-1的MEI-GP动力学曲线，均通过伪二阶模型拟合（插入图片）。两种分析物的初始浓度为0.5 mg/mL

图6. 以SHV特异性的MEI-GP为吸附剂，从细菌中选择性提取SHV的示意图。随后用MALDI-TOF质谱法对SHV进行特异性测定

细菌中SHV的特异性检测

MEI-GP成功从细菌中选择性提取SHV，并使用MALDI-TOF MS进行特异性测定。结果显示，MEI-GP有效消除了基质干扰，使SHV信号显著增强，质谱中呈现清晰的SHV峰。尽管微型微型gp也能去除基质，但未能吸附到SHV，表明其对表位特异性识别的重要性。此外，尽管两株细菌产生其他非SHV型β-内酰胺酶，MEI-GP依然有效区分出SHV，这归功于严格筛选的表位。

该研究首次在质谱中直观展示了细菌耐药机制，将表位印迹的特异性与质谱的敏感性结合。MEI-GP对SHV的检出限为≤2 μg/mL，细菌提取限为≤15 mg，显示出良好的检测能力。研究还指出，该策略可扩展至其他β-内酰胺酶家族的特异性检测，为抗菌治疗提供初步药物选择方案。

图6. 从3株革兰氏阴性菌(a - c ATCC®25922（大肠杆菌，不产生SHV）、D HFK417（肺炎克雷伯菌，本实验室维持，从临床标本中分离，产生SHV-1）和E ATCC®700603（肺炎克雷伯菌，产生SHV-18）中提取后的质谱，采用ni - gp提取和细菌裂解液直接检测进行比较。

3. 总结

本研究采用无催化剂的溶胶-凝胶聚合法制备了SHV特异性的MEI-GP，能够选择性吸附SHV家族的所有酶，其吸附量显著高于任何不含SHV特异性表位的参考蛋白。研究表明，MEI-GP非共价捕获的SHV分子与游离SHV分子之间发生范德华相互作用，进一步增强了SHV的吸附能力。通过表面印迹，SHV在印迹腔内快速扩散，并在30分钟内达到初始平衡。该策略结合了表位印迹的特异性和质谱的敏感性，使得从细菌中提取SHV成为可能，并在质谱中清晰呈现。MEI-GP的特异性检测策略可扩展至其他β-内酰胺酶家族，具有良好的应用前景。研究还指出，该技术的灵敏度高（≤15 mg细菌）和平均检测时间短（小于2小时），为临床抗菌治疗提供了快速、有效的决策支持。

论文链接： https://doi.org/10.1186/s12951-024-02949-9.