二维薄膜状磁性 SERS 标签具有增强的捕获和检测能力，可用于多种细菌的免疫色谱诊断

1. 引言

细菌感染对人类健康和社会经济构成严重威胁，已成为全球第二大死亡原因，每年导致770多万人死亡。及时识别病原体对治疗至关重要，目前主要采用基于培养和核酸的方法，但这些技术操作繁琐且耗时，限制了它们在临床的应用。尽管免疫学方法如免疫荧光法等已发展出快速检测技术，但仍存在灵敏度不足的问题。SERS-ICA具有高放大系数和不易光漂白的优点，但在复杂样本中多重检测仍面临挑战，如基质干扰和交叉反应。磁性纳米材料被认为是解决这些问题的有效方案，它们能够捕获分析物并去除杂质，从而提高检测的准确性。尽管已有多种磁性SERS标签被引入SERS-ICA系统，但现有材料存在再现性差和活性不稳定等缺陷，限制了其在多重检测中的应用。因此，需要进一步研究和优化磁性SERS标签，以实现对多种病原体的同时检测。

本研究提出了一种多重表面增强拉曼散射(SERS)-免疫层析（ICA）平台，该平台使用基于氧化石墨烯（GO）的膜状磁标签（GFe-DAu-D/M），可有效捕获和检测复杂样品中的多种细菌。通过在单层氧化石墨烯纳米片上逐层组装一层小的Fe3O4纳米颗粒（NPs）和两层内置0.5 nm纳米间隙的30 nm AuNPs，并与4-巯基苯基硼酸（MPBA）和5,5 ' -二硫代比斯-（2-硝基苯甲酸）共改性，制备了具有通用细菌捕获能力的二维gfe - dad /M标签。GFe-DAu-D /M可以通过MPBA快速富集多种细菌，通过特异性抗体对测试品系上的目标细菌进行定量分析，从而实现磁富集效应和多层密集热点的多重信号放大，消除实际应用中的基质干扰。

图1. a)薄膜型GFe-DAu-D/M探针的制备和b) GFe-DAu-D/M-ica复合检测金黄色葡萄球菌、伤寒葡萄球菌和铜绿假单胞菌的示意图。

2. 结果与讨论

薄膜型磁性GFe-DAu-D/M标签的制备与表征

该研究团队设计了一种柔性薄膜状磁性SERS标签（GFe-DAu-D/M），用于通过免疫捕获分析（ICA）实现多种细菌的高灵敏度检测。该标签由单层氧化石墨烯片和大量负载的Fe3O4纳米颗粒构成，形成二维磁性纳米膜，并通过两层Au纳米颗粒（AuNPs）增强其拉曼信号。采用超声辅助自组装策略，标签的合成过程分为七个步骤，确保了各组成部分的均匀分布和良好的磁响应性。研究结果表明，所设计的多层磁性纳米片具有优异的稳定性和SERS活性，能够在复杂环境中保持性能，适合用于细菌检测。

图2. 磁性gfe - dau /M纳米膜的结构表征。a)单层GO， b) GFe, c) GFe - au, e) GFe - au - pei和g) GFe - dau纳米膜的透射电镜图像。局部放大的TEM图像d) GFe-Au, f) GFe-Au - pei和h) GFe-DAu。i) GFe, j) GFe - au和k) GFe - dau纳米片的SEM图像。l)典型GFe-DAu纳米片的EDS元素线扫描图和m)元素映射图。

GFe-DAu纳米片的X射线光电子能谱（XPS）分析显示其表面元素包括C、Fe、O和Au，且不同元素的化学状态被清晰识别。紫外可见光谱表明，在GFe纳米片上涂覆两层AuNPs后，出现了强烈的表面等离子体共振吸收峰。磁性能测试结果显示，组装在氧化石墨烯上的Fe3O4纳米粒子显著提高了磁性响应性，饱和磁化值从19.5 emu g−1增加至76.3 emu g−1。尽管MPBA分子的SERS信号较弱，但DTNB分子在GFe-DAu纳米片上表现出更强的拉曼信号，因此选择DTNB/MPBA比例为3:1进行表面修饰以优化细菌检测性能。

图3. GFe-DAu-D /M纳米片的宽扫描XPS光谱a)和相应的高分辨率b) C 1s、Fe 2p、O 1s和Au 4f光谱。c)磁性SERS纳米片的紫外可见光谱。d) MPBA改性GFe-DAu、dtnb改性GFe-DAu和MPBA/ dtnb共改性GFe-DAu的SERS谱图。e) MPBA/ dtnb共改性GO、GFe、GFe - au和GFe - dau的SERS强度。f)不同盐浓度下30nm AuNPs和GFe-DAu-D /M标签的比色图和g)不同盐浓度下30nm AuNPs和GFe-DAu-D /M标签的紫外可见光谱及h)它们对应的SERS强度。

可控纳米间隙GFe-DAu-D/M标签SERS性能评价

在纳米结构中，精确构建小于2nm的纳米间隙可以实现最高和最稳定的电磁增强。研究中使用阳离子聚乙烯亚胺（PEI）在GFe-Au纳米片和第二层AuNPs之间建立了这种纳米间隙。PEI形成的多孔聚合物层具有强正电性，允许小的拉曼报告分子自由进入并形成高效热点。通过调节反应时间，可以精确控制PEI层的厚度，TEM图像证实了GFe-Au纳米片的成功制备。实验表明，0.5 nm PEI间隙的GFe-DAu产生了更强的SERS信号，增强因子达到1.08×10⁸。此外，有限差分时域（FDTD）模拟显示，在0.5 nm间隙中，强烈的电场耦合形成了大量热点，显著提高了SERS活性。

图4. a)使用PEI层在GFe-Au纳米片和第二层aunp之间构建精确纳米间隙的示意图。透射电镜图像显示了b) GFe-Au, c) GFe-Au - pei和d) GFe-DAu纳米片表面形貌的差异。e) PEI层厚度分别为(I) 0 nm、（II） 0.5 nm、（III） 1 nm、（IV） 2 nm的GFe-Au-PEI纳米片的TEM图像。这些纳米片表面结构的相应放大TEM图像如图(V) - (VIII)所示。f)不同PEI层厚度（0 ~ 2 nm）的GFe-Au纳米片和g)不同PEI层厚度（0 ~ 2 nm）的GFe-DAu纳米片上DTNB/MPBA分子SERS谱的比较。h)用于FDTD计算的GFe-Au (I)和GFe-DAu （II）纳米片的三维模型。i) GFe-Au和j) GFe-DAu在PEI层厚度分别为(j) 0.5 nm、(k) 1 nm和(l) 2 nm时的电磁分布。

ICA平台中GFe-DAu-D/M标签通用检测能力评价

GFe-DAu-D/M标签作为一种通用检测工具，展示了对多种细菌和常见病原体的快速捕获能力。实验结果表明，经过10秒培养后，该标签能够有效结合金黄色葡萄球菌、伤寒葡萄球菌和铜绿假单胞菌，捕获效率超过96%。即使在短时间内（2分钟），捕获效率也保持在约90%。与传统的球形Fe3O4@Au-MPBA标签相比，GFe-DAu-D/M在细菌结合和捕获能力上表现更优，归因于其二维膜状结构的大表面积和活性位点。

该标签被引入免疫捕获分析（ICA）平台，用于从复杂样品中广泛捕获目标细菌，并通过SERS进行定量检测。实验验证了GFe-DAu-D/M的多通道检测能力，显示出良好的选择性和准确性。优化实验确定了关键参数，如NC膜孔径、缓冲液组成和细菌捕获时间等，以提升检测性能。

图5. a-k)捕获GFe-DAu-D /M标签对三种常见病原体的能力。a)金黄色葡萄球菌，b)伤寒葡萄球菌，c)铜绿假单胞菌的TEM图像和d) GFe-DAu-D / M-S形成的复合物。e) gfe - dad / M-S。f) GFe-DAu-D / M-P。绿脓杆菌。(g) GFe-DAu-D / M-S的SEM图像。h) GFe-DAu-D / M-S。i) GFe-DAu-D / M-P。绿脓杆菌复合物。j)平板培养结果显示GFe-DAu-D /M捕获后上清中剩余病原体的数量。k)计算GFe-DAu-D /M对三种目标细菌的捕获效率。l - 0) GFe-DAu-D / M-ICA对目标菌的选择性。l)比色图像，m) 1331 cm−1处的详细SERS信号，n) ICA条带上三条T线对应的SERS强度。o)不同样品对应T线的典型SEM图像。

GFe-DAu-D/M-ICA平台的细菌检测性能

在确定检测条件后，研究使用铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌验证了GFe-DAu-D/M-ICA试纸条的分析性能。实验通过平板菌落计数测定细菌浓度，并采用磁性SERS-ICA方法检测不同浓度的细菌样品。结果显示，GFe-DAu-D/M-ICA条能够快速结合细菌，并在目标浓度为102 cells mL−1时仍能清晰可见。SERS信号与细菌浓度呈正相关，检测限为10 cells mL−1（铜绿假单胞菌）、11 cells mL−1（伤寒沙门氏菌）和9 cells mL−1（金黄色葡萄球菌）。与传统AuNP-ICA相比，GFe-DAu-D/M-ICA的灵敏度提高了100倍。

此外，该平台具备同时检测多种病原体的能力，能够在一次检测中分析不同细菌的混合样本。实验结果表明，T线上的信号强度与细菌浓度变化一致，且该平台显示出良好的特异性和重复性。

图6. GFe-DAu-D / M-ICA平台在单一病原体检测中的分析性能。a)铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、b)伤寒沙门氏菌（S. typhi）和c)金黄色葡萄球菌（S. aureus）检测的ICA平台的照片(I)、SERS测绘图像（II）、T线上SERS强度（III）和相应的校准曲线（IV）。d)用于(I)铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、（II）伤寒沙门氏菌（S. typhi）和（III）金黄色葡萄球菌检测的标准基于aunp的ICA结果图像。

在实际环境监测和临床诊断中，快速同时检测多种病原体的需求日益增加，以减少检测次数和成本，并提高效率。传统的检测技术如培养、PCR和ELISA往往复杂且耗时。为此，研究提出了结合GFe-DAu-D/M标签的SERS-ICA平台，具备广谱捕获能力和高效检测能力，能够在一次检测中分析多种病原体。

通过使用GFe-DAu-D/M-ICA试纸进行多通道分析，研究验证了该平台对混合样本中铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的检测性能。结果显示，T线的比色信号与细菌浓度呈正相关，且在浓度超过100 cells mL−1时可进行定性筛选。该平台的灵敏度、特异性和重复性均得到良好评估，表明其在复杂样品中的定量检测能力。此外，通过测试多种致病菌的特异性，结果显示该平台对目标病原体具有高选择性和准确性。

图7. a) GFe-DAu-D / M-ICA同时监测铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的照片。b-d)不同浓度目标病原体下三条T系的平均SERS信号。e)铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、f)伤寒沙门氏菌（S. typhi）和g)金黄色葡萄球菌（S. aureus） SERS检测对应的校准曲线。评价GFe-DAu-D / M-ICA对目标病原体的特异性：h)试纸照片和i)相应的SERS光谱和j)三条T线的强度。

在实际示例中的应用

GFe-DAu-D/M-ICA平台展现了优异的磁富集能力、稳定性和超高的检测灵敏度（10 cells mL−1），在实际复杂样品中检测低浓度病原体方面具有巨大潜力。研究通过在健康人尿液和未经处理的湖水中添加铜绿假单胞菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，评估了该方法在临床检测和环境监测中的性能。结果显示，SERS信号随着病原体浓度降低而稳定变化，平均回收率为83.88%至120.80%，RSD值为3.94%至14.03%，证明了该平台在复杂样品中的定量检测准确性和可靠性。

进一步分析显示，该平台在尿路感染患者的临床尿液样本中表现出100%的检测准确率，并与标准培养法结果高度一致，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的相关系数分别为0.872和0.961。检测时间小于25分钟，显著短于传统培养法的24小时以上。

图8. a) GFe-DAu-D / M-ICA检测的37份uti阳性样品的t线SERS强度，其中大肠杆菌阳性15份，铜绿假单胞菌阳性12份，金黄色葡萄球菌阳性10份。b、c)建议的SERS-ICA与标准定量尿液培养在临床尿液样本中检测b)铜绿假单胞菌和c)金黄色葡萄球菌结果的比较。

3. 总结

本研究报道了一种多重表面增强拉曼散射(SERS) -免疫层析（ICA）平台，该平台使用基于氧化石墨烯（GO）的膜状磁标签（GFe-DAu-D /M），可有效捕获和检测复杂样品中的多种细菌。通过在单层氧化石墨烯纳米片上逐层组装一层小的Fe3O4纳米颗粒（NPs）和两层内置0.5 nm纳米间隙的30 nm AuNPs，并与4-巯基苯基硼酸（MPBA）和5,5 ' -二硫代比斯-（2-硝基苯甲酸）共改性，制备了具有通用细菌捕获能力的二维gfe - dad /M标签。GFe-DAu-D /M可以通过MPBA快速富集多种细菌，通过特异性抗体对测试品系上的目标细菌进行定量分析，从而实现磁富集效应和多层密集热点的多重信号放大，消除实际应用中的基质干扰。该技术可同时直接诊断金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门菌3种主要病原菌，检出限可达10个细胞mL−1。该方法在实际尿路感染标本的检测中也表现出良好的性能，表明GFe-DAu-D / M-ICA平台在高灵敏度监测细菌感染或污染方面具有很大的潜力。

论文链接：https://doi.org/10.1002/smll.202310014