1. 引言

近年来，随着现代医学的进步，免疫功能低下的个体数量显著增加，导致侵袭性真菌感染（IFIs）成为发达国家和发展中国家重要的健康问题。真菌已成为全球数十亿感染的病原体，每年造成约150万人死亡。IFIs的增加与抗肿瘤药物、免疫抑制剂及侵入性治疗的广泛使用密切相关。主要病原菌包括白色念珠菌、曲霉菌和隐球菌等。目前缺乏有效的抗真菌疫苗，治疗选择主要限于唑类、棘白菌素和多烯类药物，过度使用抗真菌药物增加了耐药性风险。传统诊断方法存在特异性不足的问题，而分子技术如PCR和MALDI-TOF MS虽然有效，但在临床应用中面临设备要求高、操作复杂等限制。相比之下，环介导扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）等新技术因其在恒温下进行核酸扩增的优势，更适合现场诊断。

本研究报道了一种通过几丁质亲和磁分离（AMS）结合RPA-CRISPR/Cas12a一锅检测系统快速准确定量检测白色念珠菌的亲和分子分析方法。如图1所示，通过利用几丁质AMS技术结合RPA-CRISPR/Cas12a一锅检测系统构建亲和分子平台的工作流程。首先，针对真菌细胞壁的独特成分甲壳素进行捕获，采用碳水化合物结合模块（CBP）与几丁质相互作用。通过等温滴定量热法评估CBP与几丁质的亲和力后，将亲和力最高的CBP与羧基磁珠结合形成珠-CBP复合物。接下来，在25°C下孵育30分钟，从临床样本（如血液和肺泡灌洗液）中捕获真菌细胞，并用磁力分离器去除杂质。随后，裂解真菌细胞并提取基因组DNA，优化样品制备方案以提高效率。使用白色念珠菌特异性引物通过RPA扩增目标序列，整个样品到结果的周转时间在2.5小时以内，其中包括动手时间、RPA反应及珠状捕获和孵育时间。

图1. a真菌细胞壁的结构。b甲壳素的化学结构。c甲壳素与CBP的静电电位表面图。d羧基磁珠与CBP的耦合。e亲和分子法检测真菌流程图：(1)mb -蛋白复合物捕获真菌：将配合物加入样品中，孵育30min，捕获真菌细胞。(2)将捕获的真菌用裂解缓冲液在55℃裂解5 min，然后在室温（RT）下用硅羟基磁珠孵育10 min，提取基因组DNA。(3)核酸检测采用单锅检测系统或qPCR法。样品到结果的周转时间在2.5 h以内，包括30-50分钟（与样品数量相关）的动手时间，40分钟的RPA-CRISPR/Cas12a反应，50分钟的珠状捕获和孵育。

2. 结果与讨论

CBP的纯化及与几丁质的结合亲和力鉴定

研究团队从蛋白结构数据库筛选出适合的CBP蛋白，并通过罕见密码子分析和密码子优化合成了多个质粒，以实现高效表达和纯化。使用大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达后，通过Ni²⁺-NTA亲和层析柱纯化获得了七种高纯度可溶性CBP。随后，研究人员利用等温滴定量热法（ITC）评估了这些纯化CBP与几丁质的结合亲和力，发现它们具有中等亲和力，其中PfCBP-A的结合亲和力最高，平衡常数KD为2.11±1.37 μM，显著优于其他CBP。这一研究为开发基于几丁质的真菌检测提供了重要基础，展示了CBP在真菌细胞捕获中的潜在应用价值。

图2. a白色念珠菌的检测原理是基于几丁质与CBP的相互作用。b蛋白纯化和亲和验证流程图。c SDS-PAGE（12.5%）显示几丁质结合蛋白的诱导表达谱和纯化阶段。标记：分子质量标记；细胞裂解：超声诱导细胞裂解；上清：诱导细胞裂解液在13,000×g离心30 min，收集上清；并流过：除了带有his-tag的靶蛋白与Ni2+-NTA柱结合外，其他物质和杂蛋白均直接流过该柱。Wash1-Wash3：分别用含50 mmol/L咪唑、65 mmol/L咪唑、80 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液50 mL洗涤柱。洗脱：从Ni²⁺-NTA柱上洗脱目标蛋白。d 7个纯化的可溶性CBP。e几丁质与亲和蛋白结合的模型。f、g ITC分析测定几丁质与CBP （PfCBP-A和PfCBP-B）的结合亲和力。

AMS检测方法的应用与优化

研究人员探讨了七种候选蛋白（ChBD2、ChBD3、EfCBP-1、PfCBP-A、PfCBP-B、BcCBP-1和ScCBP-1）与几丁质的亲和力和特异性。研究中将这些蛋白与羧基磁珠偶联，发现大分子蛋白在饱和磁珠方面表现优于小分子蛋白，因此选择了分子量最高的PfCBP-A进行进一步测试。通过粒度分析和BCA法测定结合效率，结果显示MB-PfCBP-A复合物在562 nm处的吸收强度更高，证实了其成功偶联。在捕获白色念珠菌细胞的实验中，所有七种复合物均能有效捕获真菌细胞，但MB-PfCBP-A和MB-PfCBP-B的基因组DNA浓度显著高于其他复合物，表明PfCBP-A是首选候选物。为了验证其特异性，研究还测试了40株真菌和10株细菌，结果显示MB-PfCBP-A对真菌细胞壁上的几丁质具有特殊亲和力，能够有效捕获目标真菌，而对缺乏几丁质的细菌则无反应。

图3. a结合后mb -蛋白复合物的蛋白浓度使用BCA测定法进行评估。b羧基磁珠（MB）和MB-蛋白复合物（MB- pfcbp - a）粒度分析。c检测饱和所需蛋白1mg磁珠。预偶联蛋白PfCBP-A、MB-PfCBP-A复合物及相应的上清液采用12.5% SDS-PAGE，考马斯蓝染色。d 7种CBPs分别以不饱和剂量与羧基磁珠偶联。e MB-protein-C提取的白色念珠菌基因组DNA浓度。白念珠配合物使用硅羟基磁珠。f用qPCR法验证DNA浓度和纯化。

白色念珠菌一锅检测平台的建立

在对白色念珠菌进行基因比较后，研究团队选择了其CHS1基因作为目标，并设计了特异性RPA引物F7和R7。经过优化，最终确定这对引物能够有效扩增136 bp的目标序列。高通量测序显示了扩增产物的突变率和分布。研究还将RPA与CRISPR/Cas12a结合，形成一锅视觉检测系统，以简化分析过程并降低气溶胶污染风险。为了评估该系统的灵敏度，与qPCR法进行比较时，白色念珠菌基因组DNA的稀释范围为3.8 × 10⁻¹到3.8 × 10^-6 copies/µL。结果显示，两种方法的检测限相同，均为3.8拷贝/µL，而单锅检测系统的灵敏度比qPCR高约100倍。特异性测试表明，只有白色念珠菌DNA产生了明显的荧光信号，而其他病原体的DNA则未显示阳性反应。

图4. a本实验中白色念珠菌CHS1基因的靶序列及RPA引物和crRNA的位置。b RPA-CRISPR/Cas12a一锅视觉检测系统方案。c， e用10倍连续稀释的白色念珠菌基因组DNA验证单锅检测系统的灵敏度。d， f白念珠菌基因组DNA单锅检测系统的特异性。c， d不同浓度靶标的实时荧光强度变化。e， f蓝光下直接可视化荧光信号检测。g， h利用qPCR检测白色念珠菌基因组DNA的灵敏度和特异性。

血液及支气管肺泡灌洗液白色念珠菌亲和分子检测平台

通过模拟阳性血液和支气管肺泡灌洗液（BAL）样本，评估了AMS方法在临床样本中检测白色念珠菌的可行性。由于血液中存在大量非目标物质，模拟血液样本采用两步流程，从全血和分离血浆中捕获白色念珠菌。结果显示，在相同浓度下，全血样本与血浆样本的检测结果有显著差异，因此选择全血样本进行后续实验。特异性研究表明，使用不同干扰因素时，AMS反应与空白对照相似，证明该方法能够特异性识别白色念珠菌。进一步的灵敏度评估显示，随着白色念珠菌浓度的增加，荧光强度逐渐增强，并与浓度呈线性关系。与qPCR相比，AMS方法在灵敏度上表现更优，且在检测临床样本时具有93.93%的敏感性和100%的特异性。此外，亲和分子分析法在80个模拟阳性临床样本和40个阴性样本中的应用结果显示，该方法在低浓度样品中表现出明显优势。最后，通过SDA平板培养技术评估MB-PfCBP-A复合物对白色念珠菌的捕获效率，结果表明捕获后的真菌细胞仍能存活。

图5. a AMS技术检测模拟白色念珠菌阳性血液样本的性能：20份血浆样本（蓝色）和20份全血样本（红色）。b . AMS-qPCR检测的抗干扰能力。模拟临床样本（血液和BAL）作为空白组，干扰光秃梭菌、肺炎克雷伯菌和白色梭菌的基因组DNA。c分别从血液和BAL样品中检测白色念珠菌的亲和分子分析法的LOD。在蓝光下用肉眼直接观察荧光。NC：表示无底物的反应。d-f线性回归分析。g不同浓度白色念珠菌对血液和BAL样品进行真菌荧光染色，显示富含几丁质细胞壁的荧光钙。h-i亲和分子检测用于模拟临床样品和临床样品。h模拟样本。i临床样本。j临床样本检验的ROC曲线分析。

小鼠弥散性白色念珠菌感染亲和分子检测平台的可行性

为评估抗真菌治疗的反应性，向45只雌性BALB/c小鼠静脉注射了3×10⁵ CFU的白色念珠菌，并在感染后5小时开始对小鼠进行氟康唑治疗。结果显示，氟康唑组与对照组在肾脏真菌负荷上存在显著差异，表明小鼠模型的成功建立和抗真菌治疗的有效性。使用亲和分子法检测小鼠全血，发现PBS处理组在不同时间点荧光信号较亮，而氟康唑治疗组的荧光信号逐渐减弱，治疗7天后有样本未检测到荧光信号。与qPCR检测结果一致，未被MB-PfCBP-A复合物捕获的样本与捕获样本之间存在显著差异。组织病理学评估显示，氟康唑组小鼠肾脏组织的炎症浸润明显少于对照组，且抗真菌治疗后白色念珠菌数量减少。

图6. 将小鼠随机分为三组：空白对照组（blank control）、感染小鼠并给药（PBS单独对照组）、感染小鼠并给药氟康唑（治疗组）。a BALB/c小鼠实验示意图。b PBS和氟康唑治疗侵袭性白色念珠菌感染小鼠模型肾脏真菌负荷（蓝色为PBS对照组，红色为氟康唑治疗组）。c、d亲和分子法检测小鼠全血：c荧光监测仪读出的一锅检测系统荧光强度（蓝色为PBS对照组，红色为氟康唑治疗组，绿色为阴性对照结果）。d蓝光下荧光信号的视觉检测。e肾切片组织学分析。

3. 总结

本研究设计了一种通过几丁质亲和磁分离（AMS）结合RPA-CRISPR/Cas12a一锅检测系统快速准确定量检测白色念珠菌的亲和分子分析方法。该过程是通过制备几丁质结合蛋白（CBP）蛋白并评估其与几丁质的结合亲和力来启动的。随后，用CBP包覆磁珠有效捕获样品中的真菌细胞。然后使用硅羟基磁珠提取真菌基因组DNA，然后通过RPA-CRISPR/Cas12a系统快速扩增和一锅检测。整个操作过程可在150 min内完成，对30 CFU/mL浓度的白色念珠菌具有较高的检测灵敏度。该平台有望为真菌感染提供具有成本效益、快速、准确和即时的诊断。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.156440