MALDI-TOF质谱技术在放线菌快速鉴定中的应用

在微生物研究领域，放线菌的鉴定一直是备受关注的重要课题。近期，一项来自阿尔及利亚的研究为放线菌鉴定带来了新的曙光，尤其是在利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术对从阿尔及利亚沙漠土壤中分离出的放线菌进行快速鉴定方面取得了显著进展。

传统识别方法的局限性

放线菌，特别是链霉菌属，是一类具有重要生物技术价值的丝状革兰氏阳性细菌，它们是众多生物分子的潜在生产者，在工业、医疗和农业等领域有着广泛应用。传统的放线菌鉴定方法主要基于培养、形态、生理和代谢特征，但这些方法成本高、劳动强度大，且与分子水平鉴定方法相比存在明显局限性。分子生物学方法如16S rRNA基因测序虽有进步，但仍存在耗时耗资源的问题，难以成为常规鉴定手段。

MALDI-TOF质谱技术的崛起

近年来，MALDI-TOF质谱技术因其快速、准确和高效的特点，逐渐成为微生物鉴定的首选方法。该技术能够在几分钟内完成微生物的鉴定，且操作简便，适合临床和环境微生物的快速检测。尤其是在放线菌的鉴定中，MALDI-TOF质谱技术展示了其独特的优势。然而，对于放线菌的鉴定，由于其丝状特性、在琼脂上的菌落特征以及细胞壁较厚等原因，常规的MALDI-TOF MS鉴定面临挑战，通常需要复杂的蛋白质提取步骤，这限制了该技术在放线菌鉴定中的应用效率。

创新鉴定方案详解

为攻克这一难题，阿尔及利亚的研究团队开展了深入研究。作者从阿尔及利亚不同地区的沙漠土壤样本中分离出26株放线菌纯培养物。在鉴定过程中，首先采用传统的16S rRNA基因测序作为金标准方法对这些菌株进行鉴定。

结果显示，26株菌株中有24株属于链霉菌属，与GenBank中序列相似度达98-100%，另外2株属于Lentzea属，相似度为98-99%。但部分菌株仅靠16S rRNA基因测序无法精确到种水平，为此研究团队进一步采用rpoB基因测序分析，对10株菌株的rpoB基因区域成功扩增并测序，虽在一定程度上补充了鉴定信息，但整体上对多数菌株的分类分辨率提升有限。

针对MALDI-TOF MS鉴定，研究团队研发了一套创新的方案。先将从琼脂板上取下的菌落与β-琼脂酶一起孵育15分钟，随后进行机械裂解，并依次用磷酸盐缓冲液和乙醇洗涤。处理后的菌株样本直接点样于MALDI-TOF MS靶板，覆盖基质溶液后进行结晶和检测。实验过程中，以大肠杆菌作为阳性对照，未接种的基质溶液作为阴性对照，确保分析的准确性和有效性。

研究成果显著

经大量实验验证，该方案效果显著。在质量控制鉴定环节，参考菌株能准确在种水平被鉴定，阳性和阴性对照表现符合预期。在对26株放线菌的盲测中，利用更新后的本地数据库，所有菌株鉴定分数在1.911-2.599之间，平均处理时间仅20分钟（含基质干燥5分钟），表明该方案能实现放线菌的快速准确鉴定。

表1 本研究中用于MALDI-TOF MS新鉴定方案的26株从沙漠土壤中分离出的放线菌菌株的得分，以及它们与16S rRNA和rpoB基因序列鉴定的最佳匹配结果。

与传统的直接使用完整细胞或常规鉴定流程相比，新方案优势明显。直接用完整细胞鉴定时，光谱质量差、分数低甚至无光谱，而新方案光谱重现性达100%，能获得高质量蛋白质光谱，有效提高了鉴定的准确性和可靠性。同时，研究团队还将新获得的放线菌光谱数据整合到Bruker MALDI BioTyper Daltonik 3.0数据库中，进一步丰富了数据库资源，为后续研究提供了更有力的支持。

图1 10株放线菌菌株在2至20 kDa范围内的MALDI-TOF质谱图，Intens表示信号强度，au表示任意单位。a：Streptomyces ambofaciens（远霉素链霉菌），b：Streptomyces mutabilis（变异链霉菌），c：Streptomyces azureus（天蓝色链霉菌），d：Streptomyces pimonensis（比蒙链霉菌），e：Streptomyces sp. SHmF3SB（SHmF3SB 链霉菌），f：Streptomyces althioticus（阿尔硫链霉菌），g：Streptomyces globosus（球形链霉菌），h：Streptomyces sp. STR51SB（STR51SB 链霉菌），i：Streptomyces ruber（红色链霉菌），j：Lentzea atacamensis（阿塔卡马伦茨氏菌）。

图2 由BIOTYPER软件生成的树形图展示了收集菌株和代表放线菌生物的MALDI-TOF质谱的相似性。

结论与展望

这项研究成果在微生物学和生物技术领域具有重要意义。它成功解决了放线菌MALDI-TOF MS鉴定中蛋白质提取繁琐的问题，极大地简化和加速了鉴定流程，为放线菌的研究和应用开辟了新途径。未来，随着研究的深入和数据库的不断完善，有望进一步提高放线菌鉴定的准确性和效率，助力发现更多具有潜在应用价值的放线菌菌株，推动相关领域的发展。

参考文献：

Benhasna S, Boudemagh A. Alternative protocol leading to rapid identification of Actinomycetes isolated from Algerian desertic soil by MALDI-TOF mass spectrometry[J]. Journal of Microbiological Methods, 2024, 223: 106984.