Counter-on-chip：开启细菌精准计数的新时代

在生物医学研究和临床诊断中，准确的细胞计数对于实验的可靠性和结果的可重复性至关重要。然而，传统的细胞计数方法如平板菌落计数法和手动显微镜计数存在时间长、误差大等问题。为了解决这些挑战，研究人员开发了三代微流控细胞计数器（G1、G2和G3），利用二光子聚合（2PP）技术，显著提高了细胞计数的准确性和效率。

传统计数方法的局限性

传统的细胞计数方法主要依赖于菌落形成单位（CFU）计数，这种方法虽然经济且易于操作，但却存在诸多缺陷。CFU方法假设每个菌落来源于单一细胞，且只能计数活细胞，导致结果的准确性受到影响。此外，该方法需要较长的培养时间，通常需要等待一夜才能获得结果，这对于时间敏感的实验而言无疑是一个障碍。

手动显微镜计数法同样存在问题，尤其是在计数亚微米细菌时，容易出现人为误差。自动化细胞计数系统虽然提高了通量，但往往需要专业知识，且在计数较小细胞时仍可能出现误差。因此，开发一种新型、准确且高效的细胞计数方法成为了研究者们的迫切需求。

微流控细胞计数器的创新设计

在这一背景下，研究团队运用二光子聚合（2PP）技术制造微流控细胞计数器。该技术允许研究人员以高分辨率快速制造复杂的三维结构，突破了传统光刻技术的限制，通过优化打印和成型工艺，成功构建出高质量、可重复的计数器。研究团队基于此设计了三代微流控细胞计数器，分别为 G1、G2 和 G3，每一代设备都在前一代的基础上进行改进，显著提高了细胞计数的效率和准确性，以满足更高的计数精度和效率需求。

G1：初代计数器的构建

G1计数器采用了三种不同深度的计数室，深度为20 µm，能够准确计数1 µm和5 µm的微珠。通过与传统的Petroff-Hausser（PH）计数器进行比较，G1显示出相似的计数精度，且在样品处理和图像采集方面也取得了一定的优化。

图1. (a) G1型微流控细胞计数器原型由三个腔室、一个入口、一个出口和一个深度为20 μm（H = 高度/深度）的储液池组成。所有腔室的尺寸均以半径（r）表示。(b)扫描电子显微镜（SEM）和扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱仪（SEM-EDS）概述：(i) SEM图像验证了腔室和结构尺寸的准确性。(ii)倾斜角度的SEM图像显示了G1计数器的深度。(iii) SEM-EDS显示了G1计数器的元素特性。分析了五种不同的原子组成。添加氟（F）作为对照。(c) G1、Petroff-Hausser计数器和供应商提供的5 μm微珠数据的对比分析：(i) G1与Petroff-Hausser（PH）计数器以及供应商的计数结果相比，无显著差异（p = 0.67，n = 8），而PH计数器和供应商的计数结果存在显著差异（p = 0.008，n = 8）。(ii)组合数学方法表明，多次重复实验可减少变异；r为随机选择的数量，n为重复次数（见方法部分）。(iii)重复次数越多，变异系数越低。(d) G1可以精确计数微米级（1 μm）的微珠。(i) G1与供应商的计数结果相比，无显著差异（p = 0.07，n = 8），但与PH计数器的计数结果存在显著差异（p = 0.0004，n = 8），而PH计数器和供应商的计数结果也存在显著差异（p = 0.0002，n = 8）。(ii)重复次数越多，计数变异和异常值越少。(iii)增加重复次数可降低变异系数。w：通道宽度，n：重复次数，SEM：扫描电子显微镜，SEM-EDS：扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱仪。

G2：提升计数精度

在G1的基础上，G2计数器的设计进一步优化，采用了八个相同大小的计数室（半径50µm），深度仍为20µm。G2计数器能够在每个计数室内容纳较少的细胞，从而减少室间变异，提高了计数的准确性。研究表明，G2的总计数与CFU / mL的结果相比，误差仅为8.6%，显示出其良好的性能。

图2. (a) G2型微流控细胞计数器原型。G2有八个大小相等的腔室（每个腔室半径r = 50 μm），还有一个入口、一个出口和一个深度/高度（H）为20 μm的储液槽。(b)扫描电子显微镜（SEM）图像验证了G2的结构尺寸。(i) SEM确认了通道和计数腔室的尺寸精度。(ii)倾斜角度的SEM图像描绘了G2计数器的高度/深度（20 μm）。(c) G2能高精度地对较少数量的细胞进行计数。(i)在五次重复实验中，G2每个腔室平均含有20-35个细胞，且计数差异显著（p = 0.01，n = 5）。(ii) G2的总计数与菌落形成单位（CFU）计数相比，无显著差异（p = 0.26，n = 5）。(d) 使用活/死细胞染色试剂盒鉴定活细胞和死细胞。(i)显微镜明场成像（1000倍放大）证实了大肠杆菌细胞的存在。(ii)碘化丙啶（PI）在死细胞上显示红色荧光（激发/发射波长为493/636nm）。(iii)羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFDA-SE）在活细胞上呈现绿色荧光（激发/发射波长为492/517nm）。n：重复次数，w：通道宽度，PI：碘化丙啶，CFDA-SE：羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯。

G3：实现实时监测

G3计数器是三代产品中的最新版本，其设计进一步降低了计数室的深度至5µm。这一改进使得细胞在计数过程中更加稳定，减少了细胞重叠的可能性，从而提高了计数的可靠性。G3不仅能够提供准确的细胞计数，还能够实时监测细菌的生长情况，为细菌动态研究提供了新的可能性。

图3. G3型微流控细胞计数器原型。(a) G3由八个大小相等的腔室（半径r = 50 μm）、一个入口、一个出口和一个深度/高度（H）为5 μm的储液槽组成。(b)扫描电子显微镜（SEM）图像验证了G3结构的深度（H = 5 μm）和通道宽度（w = 20 μm）。(c)G3与预测计数相比，在估计计数上表现出很强的相关性和较小的差异。(i)将五种不同浓度（1.0×10⁸ , 2.0×10⁸ , 5.0×10⁸, 1.0×10⁹,和2.0×10⁹个珠子/毫升）的1 μm珠子与G3进行比较。每种浓度下，n = 3；R² = 0.98。(ii)较低的浓度可带来更高的计数精度和更少的差异。在这里，2.0×10⁸个珠子/毫升的浓度仅显示出5.4%的计数差异，而较高浓度，如2.0×10⁹个珠子/毫升，与预期计数相比差异达到55.3%（n = 3）。(d) G3每个腔室中的细胞数量极少，这减少了差异并提高了计数精度。(i)平均细胞数（n = 5）≤10，在腔室间计数中没有统计学上的显著差异（p = 0.58，n = 5）。(ii) G3与CFU/毫升（p = 0.22，n = 5）和Petroff-Hausser（PH）计数（p = 0.55，n = 5）相比，均无显著差异。(e)延时图像显示大肠杆菌在添加了LB培养基的G3计数器中生长。n：重复次数。

未来的研究方向

尽管G1、G2和G3计数器在细胞计数方面取得了显著进展，但仍然存在进一步优化的空间。未来的研究将集中在提升计数器的通量、扩展其适用范围以及实现更高精度的细胞计数。此外，结合新兴的成像技术和数据分析方法，研究人员希望能够实现更复杂的细胞行为监测和分析。

结论

新一代微流控细胞计数器的研发为生物医学研究和临床诊断提供了强有力的工具，突破了传统计数方法的局限。通过不断的技术创新和优化，这些计数器不仅提高了细胞计数的准确性和效率，也为实时监测细胞动态提供了新的可能性。随着研究的深入，微流控技术在细胞计数和生物医学领域的应用前景将更加广阔。

参考文献：

Rahman K M T, Butzin N C. Counter-on-chip for bacterial cell quantification, growth, and live-dead estimations[J]. Scientific Reports, 2024, 14(1): 782.