类过氧化物活性酶的纳米材料在病原细菌和病毒检测中的应用

引言

由病原细菌和病毒引起的传染病对人类健康构成重大威胁。及时识别这些病原体不仅有助于及时筛查感染者、防止进一步传播，而且有利于患者的精准诊疗。传统的检测方法如直接涂片显微镜检查、微生物培养、基于核酸的聚合酶链反应（PCR）和基于微生物表面抗原或人血清抗体的酶联免疫吸附测定（ELISA）在传染病的预防和管理中发挥了重要作用，但它们存在诸多缺陷，如应用范围有限、分辨率和灵敏度不足、耗时长、劳动强度大、成本高、操作复杂、无法区分活菌和死菌等。

在当今医学与生物技术领域，纳米材料的类过氧化物酶活性正成为病原体检测技术的一大亮点。本文将详细介绍这一前沿技术的原理及其在革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和病毒检测中的应用现状，并探讨作者对未来发展的总结与展望。

一、纳米材料的类过氧化物酶活性及其原理

纳米材料的类过氧化物酶活性是指某些纳米材料能够模拟天然过氧化物酶的催化功能，催化过氧化氢（H₂O₂）生成羟基自由基（•OH），进而氧化显色底物产生颜色变化或化学发光。这一过程与天然过氧化物酶催化反应类似，但纳米材料具有更高的稳定性和更低的成本。常用的显色底物包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）、邻苯二胺（OPD）等。

二、革兰氏阴性菌的检测应用现状

革兰氏阴性菌是一类常见的病原细菌，如大肠杆菌O157:H7，它可引起食物中毒等疾病。传统的检测方法存在诸多局限性，如分辨率和灵敏度有限、病原体培养困难、检测耗时以及需要专业人员等。纳米材料的类过氧化物酶活性为革兰氏阴性菌的检测提供了新的解决方案。

例如，利用金@铂纳米颗粒（Au@Pt）功能化4-巯基苯硼酸，通过静电吸附和与脂多糖（LPS）的相互作用快速吸附在大肠杆菌表面形成复合物，再通过离心提取进行定量分析。Au@Pt纳米酶的类过氧化物酶活性催化H₂O₂氧化TMB产生蓝色产物，检测限低至7 CFU/mL。此外，通过sandwich immunoassays基的比色检测系统，可以检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌等其他革兰氏阴性菌。例如，利用抗沙门氏菌抗体修饰的铁有机框架（Ab1-Fe MOF nanozyme）作为比色检测系统，检测限为34 CFU/mL。

图1 基于Au@Pt的过氧化物酶样活性的大肠杆菌O157:H7比色检测示意图。简而言之，Au@Pt与大肠杆菌O157: H7的结合催化H₂O₂氧化TMB，产生可以用肉眼识别或用紫外可见分光光度法监测的蓝色。

三、革兰氏阳性菌的检测应用现状

革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌，是一类重要的病原细菌，可引起多种感染性疾病。纳米材料的类过氧化物酶活性在革兰氏阳性菌的检测中也显示出巨大潜力。

例如，开发了一种基于Au@FePPOP_BFPB的纳米酶检测系统，通过范可霉素捕获金黄色葡萄球菌，再引入修饰有Ab2抗体的Au@FePPOP_BFPB，形成三明治免疫复合物，最终通过催化TMB颜色变化实现检测，检测限为24 CFU/mL。此外，利用Fe₃O₄纳米酶和Co₃O₄纳米酶进一步提高了对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度，检测限分别低至10 CFU/mL和8 CFU/mL。

图2 具有过氧化物酶样活性的Au@FePPOP _BFPB比色法检测金黄色葡萄球菌的示意图。在96孔微孔板上被万古霉素（Van）捕获后，金黄色葡萄球菌在Au@FePPOP _BFPB上与bs-4582R特异性结合。然后，H₂O₂通过Au@FePPOP _BFPB过氧化物酶样活性将无色的TMB氧化为蓝色的ox-TMB。颜色变化的程度与金黄色葡萄球菌的浓度有关。

四、病毒的检测应用现状

病毒的快速检测对于传染病的防控至关重要。纳米材料的类过氧化物酶活性在病毒检测中也取得了显著进展。

RNA病毒

新冠病毒（SARS-CoV-2）：结合铁硫化物纳米片（FeS₂）和重组酶聚合酶扩增（RPA）技术，可以缩短SARS-CoV-2的检测时间。基于双抗体夹心侧流免疫分析原理和Co-Fe@hemin纳米酶作为化学发光示踪剂，实现了对SARS-CoV-2的快速、灵敏检测，检测限为360 TCID₅₀/mL。

人类免疫缺陷病毒（HIV）：利用Au@Pt和磁铁矿纳米颗粒（MNPs）形成sandwich complexes，通过Au@Pt纳米酶的类过氧化物酶活性催化荧光红的氧化实现HIV感染的检测，检测限为5 pmol/L DNA。

埃博拉病毒（EBOV）：制备了基于铁氧化物纳米酶的侧流免疫分析试纸条，用于EBOV感染的快速筛查，检测限为240 PFU/mL。

禽流感病毒（H5N1）：提出了一种基于金离子（Au³⁺）和抗H5N1特异性抗体形成的生物共轭物的比色免疫分析方法，H5N1的检测限低至1.11 pg/mL。

诺如病毒（NoV）：开发了一种基于AG3 aptamer和AuNPs的比色传感器，实现了对NoV的超灵敏和高特异性检测，检测限为30 viruses/mL。

寨卡病毒：利用抗寨卡病毒抗体修饰的Au-Pt纳米酶作为信号放大器，实现了对寨卡病毒的检测，检测限为1 pg/mL。

图3 诺如病毒纳米酶适配体传感器示意图。通过与金纳米颗粒表面的AG3适配体相互作用，诺如病毒（而不是其他病原微生物）诱导适配体解吸，暴露金纳米颗粒表面，从而恢复纳米酶活性，以表征样品中存在的诺如病毒的数量。

DNA病毒

戊型肝炎病毒（HEV）：构建了Au@Ag纳米复合物作为比色探针，提高了对HEV的检测灵敏度，检测限为10 pg/mL。

猪圆环病毒2型：整合了兔抗猪IgG抗体修饰的Au-Pt/SiO₂纳米酶和H₂O₂/HAuCl₄显色底物作为检测系统，检测限达到了1:10⁷稀释的阳性猪血清样本中的猪圆环病毒2型抗体。

五、总结与展望

文章总结了具有类过氧化物酶活性的纳米材料在病原细菌和病毒检测中的应用，强调了纳米酶作为一种新型的检测工具，具有巨大的潜力。然而，要实现纳米酶的工业化应用并解决实际问题，还需要各方面的共同努力。具体挑战包括：

催化活性：纳米酶的催化活性仍低于天然酶，但可以通过调整纳米材料的物理化学特性（如大小、形状、表面电荷、化学组成）、添加小分子（如ATP）、光和超声等刺激以及其他环境因素（如pH、温度等）来优化。

底物选择性：需要进一步研究纳米酶的催化活性与底物选择性之间的差异，通过在纳米酶表面交联识别分子来提高底物选择性。

样本微环境的影响：纳米酶在高盐度和宽pH范围的恶劣环境中可以高效稳定地催化反应，但实际样本中可能存在的其他无关物质（如蛋白质和金属离子）可能会吸附到纳米酶表面并干扰检测。

多酶模拟活性：某些纳米材料具有多种酶模拟活性，这些活性可能会分解同一底物H₂O₂产生不同的产物，导致检测灵敏度和准确性降低。

H₂O₂的稳定性：H₂O₂作为过氧化物酶模拟物的必要底物，容易分解且对人类健康和环境有害。相比之下，O₂更稳定、更安全且易于获取，因此具有氧化酶样活性的纳米材料是更好的选择。

大规模应用：尽管纳米酶在实验室研究中表现出色，但其大规模应用仍面临巨大挑战。

环境和健康风险：纳米酶的制备可能涉及有毒有害试剂，且由于其高稳定性，纳米酶在自然环境中可能长期存在，因此其生物相容性和生物可降解性是评估其实际应用潜力的重要因素。

多技术集成：通过将纳米材料的酶样活性与其磁性、热性和光学性质相结合，并利用微流控技术、侧流试纸条和智能手机的数字成像与分析技术，可以加速纳米酶在实际应用中的推广。

综上所述，具有类过氧化物酶活性的纳米材料在病原体检测中显示出巨大的潜力，但要实现其实际应用，还需要在多个方面进行深入研究和优化。未来，随着技术的不断进步和多学科的交叉合作，纳米材料的类过氧化物酶活性有望在病原体检测领域发挥更大的作用，为人类健康保驾护航。

参考文献：

Luo C, Li X, Li Y. Application of the Peroxidase‒like Activity of Nanomaterials for the Detection of Pathogenic Bacteria and Viruses[J]. International Journal of Nanomedicine, 2024: 441-452.