基于DNA水凝胶和复合功能纳米材料的三合一CRISPR平台超灵敏检测诺如病毒

诺如病毒是一种人畜共患的病原体，可在世界范围内引起人类和许多动物的急性胃肠炎和严重腹泻，也是一种重要的食源性疾病病原体。病毒爆发通常会导致重大的经济损失，并对社会产生长期的负面影响，对公共卫生构成重大挑战。

有各种常用的病毒核酸检测方法，包括培养细胞的显微镜观察、酶联免疫吸附测定、聚合酶链反应等。RT-PCR被广泛认为是诊断性核酸扩增的金标准，这是由于其异常的灵敏度和准确性。然而，RT-PCR需要专门的仪器、复杂的引物和耗时的实验程序。ELISA具有操作简单、反应快速、特异性强、实验设备要求简单等优点，但其灵敏度较低，对样品制备要求较严格。此外，病毒培养的方法非常耗时，并且需要大量的专业知识和精确度。此外，现有的检测方法耗时长，操作复杂，需要复杂的仪器，限制了其在病毒检测中的应用。因此，有必要发展快速、简便、高灵敏度和高准确度的检测方法。

CRISPR-Cas被认为是核酸检测的强大工具。迄今为止，已经开发了各种基于CRISPR的方法，通常涉及CRISPR-Cas酶，如Cas12a或Cas13a。荧光技术因其高灵敏度、高选择性和易操作性而被用于与CRISPR-Cas结合，并被广泛用于医疗诊断和分析。在迄今为止报道的各种病毒检测方法中，基于荧光纳米颗粒的生物传感器具有高灵敏度、高选择性、高通量和低成本的优势。

近年来，金纳米粒子(Au Nanoparticles, AuNPs)因其易于合成和修饰，以及表面等离子体共振特性、高消光系数和良好的生物相容性而受到广泛关注。为了充分利用其高亮度系数和表面增强能力，球形核酸和内部纳米间隙Au@Au纳米粒子也作为金属核壳纳米粒子在生物医学中具有重要的应用前景。纳米结构生物传感器具有以下优势:灵活的传感机制、高特异性和灵敏度，以及无标记和快速实时检测。

此外，通过互补DNA链的分子杂交或交联形成的DNA水凝胶在生物传感器系统和生物医学分析中显示出有希望的潜力。在众多基于DNA水凝胶的传感系统中，有效制备大体积DNA材料的最常用方法是滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)技术，该技术优先依赖于含有刺激响应单元的聚合DNA链的产生。这些位点与外部生物分子和温度发生反应后，水凝胶分解并释放出嵌入的信号单元。然而，在测量复杂基质时，这些系统的刺激响应性、分子识别能力和催化反应很容易受到影响，从而影响传感器的性能。目前，大多数传感器基于单一传感模式，这可能会影响定量测量的准确性。相比之下，多模式传感策略不仅具有单一传感模式的特点，而且可以使用多种传感模式来验证测量结果。因此，增加测量信号输出模式的数量有利于提高测量的可靠性。考虑到这些因素，开发多模式传感系统对于实现诺如病毒的高灵敏度和精确检测至关重要。

近日，江南大学食品学院食品安全与质量控制中心孙秀兰团队在Journal of Hazardous Materials期刊上发表了题为：Ultra-sensitive detection of norovirus using a three-in-one CRISPR platform based on a DNA hydrogel and composite functional nanomaterials的论文。

为解决上述问题，本研究开发了一种用于诺如病毒超灵敏检测的三合一平台，该平台基于与复合功能纳米材料结合的DNA水凝胶。该平台基于超灵敏荧光、比色识别和表面增强拉曼光谱(SERS)。与单组分纳米材料相比，GCSNA纳米杂化材料应表现出增强的物理化学和光学性质，以及优越的生物传感性能，满足不同检测场景的要求。

如图1所示，诺如病毒GII-4的3合1检测平台包括三个部分:3合1探针GCSNAs的合成(A)，通过构建两个部分互补的环状DNA制备含GCSNAs的DNA水凝胶(B)，通过靶的RT-RPA扩增反应及其产物活化的CRISPR Cas12a降解含GCSNAs的DNA水凝胶释放GCS nas(C)。图1C是3合1检测平台的主要部分。如图1A所示，球形核酸(SNA)是通过Au -PolyA亲和方法将PolyA DNA固定在AuNPs表面上而合成的。含有AuNP (GCNP)的Gap通过用polyA和PATP修饰的还原AuNP种子合成，并且PATP作为拉曼报告分子嵌入gap中。最后，将ssDNA-FAM固定在GCNP表面，制备含缺口的球形核酸(GCSNA) 3合1探针。如图1B所示，设计了两个部分互补的环状DNA，PLC-DNA1和PLC-DNA2，通过RCA反应后产生的长单链固态DNA(L-固态DNA)之间的交叉互补和物理缠结形成DNA水凝胶。在这个过程中，3合1探针被嵌入到DNA水凝胶中，产生了含有酒红色GCSNAs的DNA水凝胶。如图1C所示，当GII-4诺如病毒存在时，其特异性RNA序列将被转化并通过RT-RPA扩增到dsDNA中，并激活CRISPR-Cas12a的非选择性ssDNA切割活性，水凝胶中包含的3合1探针将被释放。通过这种方式，可以实现对目标病毒的三重检测。通过监测在一定范围内DNA水凝胶中捕获的GCSNAs信号的泄漏，可以实现诺如病毒的高度灵敏的定量。本研究制备了具有荧光、比色和拉曼信号的三合一报告探针GCSNAs。与单组分纳米材料相比，GCSNAs表现出增强的物理化学和光学性质，以及优越的生物传感性质，可应用于不同的检测场景。基于GCSNAs开发了一种独特的检测诺如病毒的三模式生物传感器，通过荧光、比色和拉曼模式检测微量诺如病毒，满足了不同检测场景的要求。比色传感模式允许半定量的现场检测，这是肉眼可见的，定量检测可以通过使用智能手机的“颜色抓取”功能进行灰度分析来实现。

图1 基于DNA水凝胶打捞策略的三合一平台示意图。(A)功能纳米材料GCSNAs的制备。(B)环状DNA的制备、调取和功能性GCSNA纳米材料的包埋。(C)用于诺如病毒超灵敏检测的三合一平台，基于DNA水凝胶与复合功能纳米材料的结合。

研究人员接下来进行了含间隙的球形核酸纳米粒子(gap-containing spherical nucleic acid nanoparticle, GCSNA)探针的表征。通过透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)对AuNPs和GCSNAs进行表征。如图2A-B所示，颗粒尺寸从14 nm增加到42 nm，并且所有颗粒都表现出良好的分散性和均匀性。这里应该注意的是，GCSNAs包含均匀的内部纳米间隙，并且拉曼报告分子(the Raman reporter molecule, PATP)被包埋在GCSNAs内。发现对于SNA、GCNP和GCSNAs物质，AuNPs的紫外(ultraviolet, UV) 521 nm吸收峰分别红移至527、542和549 nm，从而表明在反应过程中颗粒尺寸逐渐增大(图2C)。事实上，动态光散射(DLS)实验显示了颗粒尺寸从24到32、58和78 nm的特定变化(图2D)，这与UV结果一致。图2E显示了AuNP、SNA、GCNP和GCSNA物种的ζ电势，其用于评估各种物种的稳定性。更具体地说，随着颗粒尺寸的增加，绝对电位降低，导致溶液稳定性降低。值得注意的是，GCSNAs在高浓度盐离子的溶液中保持稳定，外层ssDNA的柔软外壳赋予溶液更大的稳定性。GCSNAs内部均匀的纳米间隙允许PATP嵌入这些物种中。因此，受益于内置的SERS“热点”，其不同于由纳米颗粒聚集引起的拉曼增强，产生了显著增强的拉曼信号(图2F)，其中观察到对应于PATP的代表性拉曼峰。

图2 三合一探针的合成与表征。(A) AuNPs的透射电子显微镜TEM图像。(B) GCSNAs的TEM图像，(C)紫外吸收光谱，(D)动态光散射(dynamic light scattering, DLS)图像，(E)ζ电势，以及(F) AuNPs、PATP、SNA-PATP和GCSNAs的拉曼光谱。

为了还进行了纯DNA水凝胶和DNA水凝胶/GCSNA复合物的制备和表征。使用环境SEM、干燥SEM和冷冻干燥SEM进一步观察了纯DNA水凝胶和DNA水凝胶/ GCSNA复合物的形态，大小和微观结构。如图3A和3B所示，被困在DNA水凝胶中的颗粒在环境SEM观测值中引起明显的表面粗糙度。干燥的SEM图像表明，基本的结构单元显示出类似的花样微结构（图3C和3D）。此外，图3E和3F的冻干SEM图像表明，纯和复合DNA系统形成了具有相对均匀的孔结构的3D水凝胶网络。

图3 纯DNA水凝胶和DNA水凝胶/GCSNA复合物的电子显微镜表征：（A，B）环境SEM图像，（C，D）干燥SEM图像，以及（E，F）冻干SEM图像。

在优化的条件下，使用荧光，比色和SERS双模式自适应感测方法检测诺如病毒的靶RNA。如图4A所示，在增加诺如病毒靶RNA浓度时，FAM在525 nm处的荧光强度逐渐增加。FAM和靶RNA浓度的对数相对于荧光强度所示。结果，发现荧光强度的变化与诺如病毒靶RNA浓度的对数成正比（0.01-1000 pm；图4C）。校准曲线具有线性拟合，方程y = 1469.48x + 5001.43，相应的相关系数为R² = 0.9966。这种荧光感测模式的检测极限（detection limit, LOD）为0.5 fM。GCSNAS表现出良好的颜色显示功能，以红色赋予DNA水凝胶，并可以进行简便的颜色比较。

使用智能手机的“颜色抓取”应用程序，评估了解决方案颜色的更改。发现R/RGB比的变化与诺如病毒靶RNA浓度的对数线性成正比（0.001-100 pm；图4C）。校准曲线具有线性拟合，方程y = 0.01982x + 0.42487，相应的相关系数为R² = 0.99607。如上所述，为定量确定的目的选择了1074 cm^-1处的GCSNA拉曼峰。图4G显示了拉曼强度的变化与诺如病毒靶RNA浓度的对数之间的关系。在这种情况下，校准曲线（图4I）的线性线性范围为0.001-1000 pm，给出方程y = 1316.15x + 5393.36，以及R² = 0.9891的相关系数。根据10个空白测量，计算出SERS适体传感器的LOD为0.16 fM。在比较上述结果后，很明显，比色传感器模式显示出较低的LOD，而SERS传感器模式具有更大的检测范围。随后通过评估空白的平均响应加三倍的标准偏差的平均响应来计算3合1系统的相应LOD，发现该LOD明显低于先前报道的方法的LOD，尤其是在比色模式中。

图4 检测曲线。（A）诺如病毒靶RNA浓度与荧光强度之间的关系，以及（B）相应的拟合曲线，以及（C）线性拟合。（D）诺如病毒靶RNA浓度与比色值之间的关系，以及（E）相应的拟合曲线，以及（F）线性拟合。（G）诺如病毒靶RNA浓度与拉曼光谱强度之间的关系，以及（H）相应的拟合曲线，以及（I）线性拟合。

研究人员还进行了特异性和应用验证。使用干扰RNA的随机序列研究了3合1平台的特异性。如图6A-C所示，与特定的诺如病毒序列相比，与非特异性随机RNA序列相对应的信号强度可忽略不计。

与靶RNA混合的非特异性随机RNA序列的正信号强度在统计学上与靶RNA在相同浓度下产生的阳性不同（P <0.05）。为了评估所提出的3合1平台的实际应用，使用了五个浓度的诺如病毒靶RNA（即0.01、0.1、0.1、1、10和100 pm）用于草莓和牡蛎样品。如图6D-G所示，草莓和牡蛎样品中的荧光，比色和SERS方法的平均尖刺回收率为91.81-105.94和94.24-117.17％，96.60–102.78和97.45–101.21 %，97.76–107.08和93.72–102.75％。此外，确定变异系数分别为1.93-5.93和1.33–5.35％，1.42–3.65和0.49–4.97％，以及1.31–5.23％和1.78–4.627％。结果表明，该检测方法简化了实验操作步骤，降低了检测成本，并可以用于疾病诊断和食品安全领域。

图5 特异性测试。荧光（A），比色（B）和拉曼（C）模式中随机干扰RNA序列的结果；具有不同浓度的靶RNA及其变异系数（E）的草莓尖峰测定法（D）的结果；牡蛎尖峰测定法（F）具有不同浓度的靶RNA及其变异系数（G）的结果。

综上所述，开发了一种独特的三型生物传感器，用于检测诺如病毒核酸，该核酸通过其荧光，比色和拉曼模式检测靶标RNA，可满足不同检测场景的要求。与现有方法相比，此方法具有许多优点。首先，使用GCSNA不需要对生物功能化或识别界面进行任何控制，这有利于其商业化和普及。此外，当将表面增强的拉曼光谱技术应用于复杂的生物学环境时，目标识别事件与信号输出系统之间的分离模式有益于最大程度地减少矩阵干扰。可以预期，通过用替代性和相应的引物序列代替目标序列，可以将该方法扩展到其他目标分析物（病毒）。此外，这种信号识别和转化方法可用于检测非核酸分子，从而为各种物质的高通量鉴定提供了基础。总体而言，这种检测方法简化了实验操作，降低了检测成本并减少了实验室人员的要求。它适用于在各种领域，例如环境分析，医学诊断和食品安全等广泛的病毒检测，为开发多模式分析和多功能传感平台开发新的途径。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2024.136523