75分钟揪出尿路“隐形杀手”：数字微流控检测技术的惊艳亮相

数字核酸检测试验是一种基于泊松分布算法的定量分析方法，通过将样本分散成大量独立的微滴（或微室），并对每个微滴中的目标核酸进行检测，根据阳性微滴的比例来估计样本中目标核酸的浓度。这种方法无需校准曲线，能够直接对目标核酸进行绝对定量，显著提高了检测的准确性和可靠性。此外，由于微滴的微小体积，扩增产物被限制在微滴内，能够显著增强信号强度，从而提高检测的灵敏度。数字核酸检测试验具有高灵敏度和准确定量的优势，适用于多种生物医学检测目标，包括核酸、蛋白质和细胞等，广泛应用于生物医学研究和临床诊断。然而，现有的数字核酸分析技术仍面临一些挑战。首先，现有的多重数字核酸分析方法通常需要多个步骤，包括核酸提取、微滴生成、核酸扩增和微滴检测，这些步骤通常需要离线操作，导致检测流程复杂、耗时且容易出错。其次，现有的集成化数字核酸分析系统虽然在一定程度上提高了自动化程度，但其分析通量仍然有限，难以满足临床诊断中对高通量检测的需求。此外，多步骤的离线操作增加了交叉污染的风险，降低了检测的准确性和可靠性。

应对上述挑战，Xie等人开发了一种集成多重数字核酸检测技术（imDDNA），该技术结合了数字微流控（DMF）和液滴微流控技术，用于快速检测尿路感染病原体。DMF模块利用电润湿（EWOD）原理，能够精确控制微滴的分配、移动、合并和分裂，从而实现复杂的样本处理操作，包括核酸提取和样本-试剂混合。液滴微流控模块则能够将微升级的反应液分散成大量皮升级的微滴，用于核酸扩增。通过负压驱动，微滴能够在模块内高效生成和收集（图1）。结合环介等温扩增（LAMP）技术（65 ℃，35 min），能够同时检测四种常见的尿路感染病原体：大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）（图2）。检测范围覆盖5个数量级（9.43到2.86×10⁴ 拷贝/μL）（图3），整个检测过程仅需75分钟。另外，研究利用23例临床样本（9例阴性，14例阳性）验证了方法的实际应用价值（图4）。结果显示，在14例阳性样本中，10例为单一感染，3例为多重感染；与传统方法相比，imDDNA技术显示出了91.1%的一致性。对于不一致的样本，作者做出的解释为：该患者曾接受过抗菌治疗，这可能导致尿液中存在大量死菌。与细菌培养仅能检测活菌不同，核酸测试不受细菌活性影响，因此imDDNA技术检测显示为肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）阳性，而传统培养法判定为阴性。这一结果凸显了在临床应用中参考患者治疗史的重要性。

总之，本研究开发的imDDNA系统，通过结合DMF和液滴微流控系统，简化了样本制备流程，并加速了扩增反应，将整个流程实验时间缩短至75 分钟，检测范围覆盖5个数量级；且可实现尿路感染样本中4种关键致病菌的同时检测，这一快速多重检测能力对于临床诊断和治疗具有重要意义。尽管如此，研究也存在一些不足。譬如，核酸回收率较低（65.6%），较高的损失率可能会影响后续检测结果的准确性。此外，研究展示了对4种尿路感染病原体的检测，但临床样本通常更为复杂，这可能给imDDNA技术带来挑战。再者，该技术需要专业的设备和操作人员，这可能限制了其在资源有限地区的普及。因此，未来的研究可能需要在检测通量、简化操作流程等方面做出努力，以进一步提高该技术的临床应用价值。

图1  imDDNA的结构设计

图2  imDDNA的工作流程

图3  不同浓度下不同细菌DNA的液滴LAMP扩增结果。上图：荧光显微镜图像显示了不同菌株基因组DNA的液滴LAMP检测结果；底部：imDDNA定量值与数字PCR的相关性（n = 3）

图4  imDDNA检测尿路感染样本的代表性结果

 原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c02578