研究背景

　　沙门氏菌(Salmonella typhimurium，简称S. typhi)是一种全球性食源性病原体，对公共卫生构成重大威胁。据估计，全球每年有约2690万例感染病例，导致约20万人死亡。这种细菌能够在多种宿主体内引起胃肠炎，并在小鼠中引发类似伤寒的全身性疾病。由于其强大的生存能力和广泛的传播途径，及时准确地检测沙门氏菌对于控制疫情和保障食品安全至关重要。传统的检测方法，如实时聚合酶链反应(RT-PCR)，虽然准确但操作复杂、耗时且需要专业人员和设备。因此，开发一种快速、简便、灵敏的检测方法具有重要的实际意义。

　　创新点及优势

　　近期，印度国家动物生物技术研究所(NIAB)和区域生物技术中心(RCB)的研究团队在《International Journal of Biological Macromolecules》上发表了一项创新研究，介绍了一种基于沙门氏菌的SifA基因的CRISPR/Cas12a的电化学生物传感器。该研究的创新点在于利用CRISPR/Cas12a的转切割活性和丝网印刷金电极(SPGE)的电化学特性，实现了对沙门氏菌的超灵敏检测。

　　图1 CRISPR/Cas12a电化学系统对伤寒沙门氏菌SifA基因的作用原理和机制：(1)由工作电极、对照电极和参比电极组成的裸电极;(2)在工作电极表面固定SH-ssDNA;(3)在SH-ssDNA固定电极上加入反应络合物(Cas12a + G1 + G2 + SifA)，启动Cas12a的裂解活性，即裂解非特异性SH-ssDNA，导致电流降低(4)。

　　具体优势如下：

　　高灵敏度：该生物传感器通过差分脉冲伏安法(DPV)实现了对SifA基因的超灵敏检测，检测限低至0.634 ± 0.029 pM，远低于RT-PCR的10 μM视觉检测限。

　　快速响应：与传统的RT-PCR方法相比，该生物传感器的检测时间显著缩短，能够在5分钟内完成检测，适合现场快速筛查。

　　便携性：SPGE电极具有良好的电导性、抗腐蚀性以及较大的阴极电位范围，适合于现场快速检测，且成本低廉，易于大规模生产和应用。

　　特异性高：通过设计特异性的导向RNA(gRNA)，该生物传感器能够特异性地识别和切割SifA基因，减少了假阳性结果的发生。

　　表1 基于CRISPR/Cas的电化学生物传感器在检测不同临床生物标志物的研究进展

　　SWV: 方波伏安法; DPV: 差分脉冲伏安法; EIS: 电化学阻抗谱。

　　研究结果

　　研究团队首先设计并合成了针对SifA基因的引物和导向RNA(gRNA)，然后通过PCR扩增SifA基因，并将其与Cas12a蛋白和gRNA混合，形成反应复合物。接着，将修饰了巯基单链DNA(SH-ssDNA)的SPGE电极浸入反应混合物中，Cas12a的转切割活性导致SH-ssDNA的切割，从而引起电流的变化。通过优化Cas12a和gRNA的浓度、反应温度、pH值等条件，研究人员成功提高了生物传感器的检测性能。

　　具体实验结果如下：

　　检测限：通过DPV检测，该生物传感器的检测限低至0.634 ± 0.029 pM，远低于RT-PCR的10 μM视觉检测限。

　　特异性：通过优化gRNA的设计，该生物传感器能够特异性地识别和切割SifA基因，减少了假阳性结果的发生。

　　稳定性：该生物传感器在4°C和37°C条件下存储14天后，电流变化无显著差异，表明其具有良好的稳定性。

　　图2 基于CRISPR/Cas12a的SifA电化学检测平台：(a)差分脉冲伏安法分析SifA基因在100 nM-1 pM的线性范围内，电流响应随着SifA浓度的增加而降低;(b)测LOD为0.634 pM时的线性回归曲线;(c)开发的电化学平台的稳定性评估，建议在4℃和37℃下的稳定性可达14天;(d) RT-PCR与CRISPR/Cas12a电化学传感器测得LOD的比较(p < 0.0001.用四个星号标记，n = 3)。

　　讨论

　　CRISPR/Cas12a系统因其独特的转切割活性而被广泛应用于生物分子检测。在该研究中，Cas12a在识别并结合SifA基因后，不仅切割目标DNA，还会非特异性地切割体系中的单链DNA(ssDNA)，这一特性被巧妙地利用来设计电化学生物传感器。与传统的基于抗体或核酸的生物传感器相比，CRISPR/Cas12a系统具有更高的特异性和灵敏度，且操作更为简便。

　　此外，SPGE电极的使用为生物传感器的便携式应用提供了可能。SPGE具有良好的电导性、抗腐蚀性以及较大的阴极电位范围，适合于现场快速检测。通过扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)和接触角测量等手段，研究人员证实了SH-ssDNA成功固定在SPGE表面，为电化学反应提供了稳定的平台。

　　总结

　　该研究成功开发了一种基于CRISPR/Cas12a的电化学生物传感器，用于检测沙门氏菌。该生物传感器具有高灵敏度、快速响应和良好的稳定性，为食源性病原体的现场快速检测提供了一种新的技术手段。与传统的RT-PCR方法相比，该生物传感器不仅检测限更低，而且操作简便，无需复杂的实验室设备和专业人员，具有重要的实际应用价值。

　　展望

　　未来，该生物传感器有望进一步改进并应用于食品安全监管、临床诊断和环境监测等领域。通过结合其他先进的技术，如固相色谱等，有望克服食品基质干扰等问题，提高检测的准确性和可靠性。此外，该生物传感器的低成本和高效能特点使其有望实现大规模生产和应用，为全球公共卫生安全提供有力的技术支持。随着技术的进一步发展和优化，该生物传感器有望在多个领域发挥重要作用，为保障全球公共卫生安全做出贡献。

　　参考文献：

　　Shrikrishna N S, Mahari S, Gandhi S. Sensing of trans-cleavage activity of CRISPR/Cas12a for detection of Salmonella[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2024. 258: 128979.