硅基双金属纳米酶增强测流免疫分析：同时检测多种环境污染物

　　研究背景

　　环境中存在多种污染物，包括重金属、非法添加剂和抗生素，这些物质具有显著的化学和热稳定性，容易通过食物链生物富集，对人类健康构成多途径暴露风险。目前常用的色谱类检测技术虽然准确灵敏，但样品前处理繁琐、检测成本高、需要专业设备和操作人员，不适用于快速筛查和现场检测，尤其是在资源匮乏地区。因此，需开发一种快速、灵敏、简单的检测方法，用于复杂环境和食品中目标污染物的检测。

　　研究思路

　　本研究致力于开发一种基于Si@Au/Ir纳米酶的三通道免疫层析试纸条(Si@Au/Ir-LFA)，用于同时检测三种目标污染物，包括镉离子(Cd²⁺)、克伦特罗(CLE)和庆大霉素(GM)。如图1a，通过聚乙烯亚胺(PEI)介导的自组装技术，利用SiO₂纳米球作为稳定的核心，PEI作为中间层，均匀吸附高催化活性的小尺寸Au/Ir双金属纳米颗粒设计了一种硅基双金属纳米酶(Si@Au/Ir)。使用4-巯基苯甲酸(4-MBA)作为双功能连接分子，通过EDC/NHS交联剂将抗体直接且高效地化学偶联到Si@Au/Ir纳米酶表面。4-MBA的巯基用于结合贵金属，末端羧基用于与抗体偶联。如图1b，三通道免疫层析试纸条包括：带有三种免疫-Si@Au/Ir标记的结合垫、样品垫、喷有Cd²⁺-BSA、CLE-BSA和GM-BSA三条T线的NC膜、质量控制C线以及吸收垫。在竞争模式下，当具有特异性抗体的免疫标签直接与样品溶液混合并负载到样品垫上进行免疫测定时，T线上的比色信号表明样品不含目标污染物。相反，如果样品溶液含有目标污染物，由于目标污染物和半抗原与免疫标签的竞争性结合，T线没有显示比色信号，标记仅被C线上的山羊抗小鼠IgG捕获(图1 bi)。随后，通过将催化底物滴到NC膜上，由于其结合了纳米酶免疫标签，从而放大了LFA条上的比色信号(图1 bii)。Si@Au/Ir纳米酶通过类过氧化物酶样活性催化H₂O₂氧化3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)生成不溶性的红棕色产物oxAEC，沉积在T线上，从而放大显色信号，提高检测灵敏度。

　　图1(a)免疫Si@Au/Ir纳米标签的制备示意图;(b)制备的基于Si@Au/Ir纳米酶的LFA用于在(i)催化之前和(ii)催化之后同时分析和检测镉离子(Cd2+)、克伦特罗(CLE)和庆大霉素(GM)。

　　研究内容及结果

　　（1）Si@Au/Ir纳米材料的制备与表征（图2）：通过静电吸附介导的层层自组装(LBL)方法成功合成了具有增强催化活性的Si@Au/Ir纳米酶。通过能量色散光谱(EDS)线扫描和扫描透射电子显微镜-能量色散X射线光谱(STEM-EDX)图像，确认了Si@Au/Ir纳米颗粒中Si、O、Au和Ir四种主要元素的分布和含量。Si和O主要位于SiO₂纳米颗粒的中心，而Au和Ir均匀分布在SiO₂纳米颗粒的外层。透射电子显微镜(TEM)和高分辨透射显电子微镜(HRTEM)观察表明，SiO₂纳米颗粒具有典型的球形结构，平均粒径约200 nm。PEI通过静电相互作用成功修饰在SiO₂表面，表面电位从-39.26 mV变为24.67 mV。Au/Ir纳米颗粒均匀覆盖在SiO₂纳米颗粒表面，其晶格间距分别为0.221 nm(Ir的(111)面)和0.233 nm(Au的(111)面)。X射线光电子能谱(XPS)分析了Au、O、Ir和Si原子的特征峰，结合X射线衍射(XRD)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析，确认了Au/Ir成功负载在SiO₂上。通过实验设计模型计算了Au/Ir纳米颗粒在SiO₂壳层中的数量，结果表明PEI介导的自组装方法实现了高负载量(1294个Au/Ir纳米颗粒)，接近理论最大值(1369个)。这种高效负载显著增强了纳米酶的比色和催化性能。

　　图2 Si@Au/铱双金属纳米酶的制备和表征。(a)Si@Au/铱纳米酶制备示意图;(b)Si@Au/铱纳米酶的STEM-EDX图像;(c)SiO2纳米珠、(d)Au/Ir纳米颗粒和(e)Si@Au/Ir纳米材料的典型TEM图像;Si@Au/Ir纳米材料(f)以及表面的Au/Ir纳米颗粒(g)和(h)的HRTEM图像;(i)Si@Au/Ir纳米酶的XPS测量光谱和Au4f(j)、O1s(k)、Ir4f(l)和Si2p(m)相应的高分辨率光谱;(n)纳米酶制备各步骤的Zeta电位。

　　（2）Si@Au/Ir纳米酶的催化性能评估（图3）：在TMB和H₂O₂同时存在以及仅TMB存在时进行纳米材料催化反应，结果表明所制备的Si@Au/Ir不仅表现出类过氧化物酶活性，还表现出类氧化酶活性。通过紫外吸收分析(652 nm)发现，Au/Ir纳米颗粒的类过氧化物酶活性比单独的Au纳米颗粒和Ir纳米颗粒更强。对其催化条件探索结果表明，Si@Au/Ir纳米酶在pH 4时表现出最佳催化活性;在20-70℃的温度范围内，其催化活性变化不大，显示出比天然酶更好的极端温度稳定性;在复杂溶液(强酸、强碱和高盐)中，Si@Au/Ir表现出优异的稳定性和催化活性，而Au/Ir纳米颗粒则发生聚集。单金属与双金属纳米酶的催化结果比较表明，双金属纳米酶具有协同催化效应。以TMB为底物时，Si@Au/Ir的Vmax(最大反应速率)为3.278×10⁻⁷ M/s，Km(米氏常数)为0.401 mM;以H₂O₂为底物时，Vmax为3.095×10⁻⁷ M/s，Km为0.297 mM。与HRP相比，Si@Au/Ir具有更低的Km值和更高的Vmax值，表明其具有更强的类过氧化物酶活性。进一步研究显示抗体修饰后的Si@Au/Ir纳米酶在652 nm处的吸光度值与未修饰的纳米酶相同，表明抗体修饰未影响其催化活性。在复杂溶液中，Si@Au/Ir纳米酶表现出良好的稳定性和催化性能，可作为免疫层析检测方法标记物。

　　图3 Si@Au/Ir纳米酶的POD活性评估。(a)不同体系的紫外吸收光谱;(b)不同pH条件下Si@Au/Ir在652nm处的紫外吸收值;(c)在20℃至70℃的温度范围内Si@Au/Ir在652 nm处紫外吸收值，误差棒表示三次测试计算的标准偏差;(d)Si@Au/Ir，Si@Ir，以及Si@Au的紫外吸收光谱;(e)Si@Au/Ir，Si@Ir，以及Si@Au的拟过氧化物酶活性(I)，以及催化TMB氧化前后652nm处的相应吸光度值(II);Si@Au/Ir的稳态动力学分析显示(f)在H2O2浓度为1 M时，反应速率与TMB浓度的函数关系，误差棒表示三次试验计算的标准偏差;(g)在TMB浓度为4 mM时，反应速率与H2O2浓度的函数关系，误差棒表示三次测试计算的标准偏差;(h)Si@Au/Ir，Si@Au/Ir-Cd2+mAb，Si@Au/Ir-CLEmAb以及Si@Au/Ir-GMmAb的紫外吸收光谱。

　　（3）多重检测的设计和优化（图4）：通过扫描电子显微镜确认了NC膜上T线的信号放大效果。然后依次优化了催化底物、NC膜、缓冲液和反应时间。三种污染物的灵敏度曲线表明，该方法在同时检测三种目标污染物时表现出良好的灵敏度，并具有良好的特异性和选择性。

　　图4 Si@Au/Ir多通道检测的设计和优化。(a)阴性样品(i)和阳性样品(ii)的测试线的SEM;(b)试纸条照片(i)以及Si@Au/Ir-LFA催化前相应的灰度值(ii)，试纸条照片(iii)以及Si@Au/Ir-LFA催化后相应的灰度值(iv)，用于评估Cd2+、CLE和GM的交叉反应性，误差棒表示三次测试计算的标准偏差;(c)多通道Si@Au/Ir-LFA在催化前后用于单个Cd2+污染物检测，(i)催化之前和(ii)催化之后的试纸条照片，(iii)试纸条的相应灰度值，(iv)用于检测Cd2+的相应标准曲线，误差棒表示三次测试计算的标准偏差。

　　（4）方法检测性能评估：与传统的基于金纳米颗粒(Au NPs)的LFA相比，Si@Au/Ir-LFA的灵敏度提升了3.21倍;与酶联免疫吸附测定(ELISA)相比，Si@Au/Ir-LFA的检测限分别低96.92、91.01和71.43倍。该方法在检测灵敏度和检测通量方面优于现有的LFA技术，同时具有较高得特异性，重复性和稳定性，能够在18分钟内完成检测，检测限低至pg/mL水平，适用于环境和食品样本中污染物的高灵敏度现场检测。

　　研究结论

　　本研究开发了一种基于硅基双金属纳米酶(Si@Au/Ir)的免疫层析试纸条(LFA)，用于在复杂样本中同时、快速、灵敏地检测三种环境污染物。建立的方法针对Cd²⁺，CLE，GM的检测限(LOD)分别为0.65 pg/mL，0.89 pg/mL，1.26 pg/mL。与传统LFA相比，灵敏度提升了1000倍以上;与商业ELISA试剂盒相比，灵敏度提升了50倍以上。该方法在污染物的现场快速检测(POCT)中具有巨大潜力，适用于环境和食品样本中多种污染物的同时检测。

　　论文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.159936