人血清白蛋白（HSA）具有巨大的医学意义，常用于临床治疗如出血、烧伤、红细胞增多症等疾病，还可在人类健康监测中作为生物标志物发挥重要作用。而精确追踪与疾病相关的蛋白质活性对于临床诊断、药物毒性监测和疾病治疗至关重要。传统的HSA检测方法，如染料结合、荧光免疫分析、液相色谱-质谱（LC-MS）、毛细管电泳等，存在成本高、操作复杂、特异性差、抗干扰能力弱等问题。小分子荧光探针因其易于制备、快速、便捷、非侵入性和非破坏性，在生物分子检测中显示出巨大潜力。然而，现有的HSA荧光探针仍存在一些问题，如水溶性差、与蛋白质共价结合导致HSA变性、易受体内药物干扰等。

冯玉宽团队设计并合成了一种基于水杨醛缩氨基甲酸酯的荧光探针NDQC，该探针在水溶液中自组装成纳米颗粒，并对HSA表现出优异的选择性和灵敏度。通过分子设计，NDQC能够特异性地结合HSA的FA1位点，从而实现对HSA的高灵敏度检测和成像。NDQC探针不仅在HSA检测中表现出色，还可以用于细胞成像、药物递送和血红素检测等实际应用，具有广泛的应用前景。

1、材料与方法

A.纳米探针的制备与表征

图 1 NDQC的合成路线

NDQC的合成路线如图1所示。

将10 μL NDQC的DMF溶液（1 mM）加入到2 mL PBS缓冲液中，利用微量移液管制备NDQC纳米颗粒溶液。随后，将该溶液体系超声处理30分钟，确保NDQC纳米颗粒在溶液中均匀分布。分别取制备好的NDQC自组装纳米颗粒溶液、HSA溶液和NDQC-HSA溶液于比色皿中，分别在室温下使用动态光散射（DLS）分析测量纳米颗粒的粒径分布。

对于形态研究，首先将铜网置于滤纸上，然后用移液管缓慢地将制备好的NDQC自组装纳米颗粒溶液（或NDQC-HSA纳米颗粒溶液）滴加到铜网表面，形成一滴液滴。静置10分钟后，用移液管去除多余的溶液，并让铜网自然干燥。最后，通过透射电子显微镜（TEM）观察纳米颗粒的形态并拍摄图像。

B.分子对接和分子动力学模拟

使用MOE 2019软件研究探针NDQC与HSA和BSA的位点特异性分子相互作用。

分子动力学模拟使用Desmond 2020软件包在Linux系统上运行，计算机为Dell Workstation T7910。将NDQC-HSA复合物的最终对接结果导入Desmond的系统构建模块作为初始结构。

C.亚细胞共定位研究

对数生长期的SW1990细胞接种于培养皿，并让其过夜生长。将细胞与HSA（5 μM）孵育30分钟，然后与NDQC（5 μM）孵育另外30分钟，随后用PBS洗涤细胞三次以去除残留的HSA或NDQC。向培养皿中加入MitoTracker Red（200 nM）或Lyso-Tracker Red（50 nM），并继续培养30分钟。去除培养基后，用PBS洗涤细胞三次以去除残留的商业染料。

D.NDQC-HSA载药纳米载体的制备

将50 μL HSA水溶液（1 mM）加入到10 mL PBS缓冲液中，随后用微量移液管缓慢加入50 μL NDQC储备溶液（1 mM），并在高速搅拌下进行操作。将上述溶液装入已煮沸并活化的透析袋中，并用PBS缓冲液透析2小时，以去除体系中的单分子和小颗粒。然后，用移液管从透析袋中取出样品，并用少量超纯水冲洗袋内，以确保样品完全转移。保持上述溶液的体积为5 mL，加入50 μL DMF中的顺铂溶液（1 mM），并孵育2小时。之后，将溶液加入透析袋中，并在超纯水中透析24小时（每3小时更换一次超纯水），以过滤掉未反应的样品。最后，用移液管从透析袋中取出样品，并用少量超纯水冲洗袋内，得到8 mL的样品溶液。

2、结果与讨论

A.探针NDQC对HSA的荧光响应

图 2 NDQC探针在检测HSA时的荧光特性

NDQC探针以其高灵敏度、高选择性和出色的抗干扰能力，展现出在HSA快速检测及生物医学应用领域的巨大潜力。在荧光滴定实验中，NDQC本身几乎不发光，但随着HSA浓度的上升，其荧光强度会逐渐增强，并且在短短1分钟内就能达到稳定状态（图2a）。此外，荧光强度与HSA浓度在0–8 μM区间内呈现出良好的线性关系，检测限低至8.49 nM（图2b），这充分证明了NDQC对HSA的荧光响应极为灵敏。在对一系列常见于生物体系和环境中的物质，如金属离子、阴离子、氨基酸以及其他蛋白质等进行荧光检测时，发现NDQC仅对HSA有显著的荧光响应，而对其他生物分子则无明显反应（图2c和图2d），这表明该探针对HSA具有极高的选择性。进一步的抗干扰和pH敏感性测试结果表明，即使在复杂的环境中存在多种干扰物质，NDQC对HSA的荧光响应依然保持稳定，并且还展现出了良好的pH敏感性。

B.感应机制研究

图 3 NDQC纳米探针的特性

荧光分子聚集时会猝灭，解聚时荧光增强。NDQC在水溶液中形成纳米颗粒（图3a），与HSA结合后解聚，荧光增强。透射电子显微镜下，NDQC和NDQC-HSA纳米颗粒呈规则球形（图3b和图3c），结合后粒径从339.4 nm减小至261.5 nm（图3d）。

通过药物置换实验发现，NDQC更倾向于与HSA的FA1位点结合，而非位点I或II。进一步分子对接模拟显示，NDQC与HSA结合能低至-105.55 kcal/mol，且分子插入FA1位点，进一步证实了NDQC在HSA中的结合位点。分子动力学模拟也表明，NDQC-HSA复合物稳定，氢键和疏水相互作用在结合中起关键作用。

C.NDQC-HSA复合物在血红素检测中的应用研究

血红素可与HSA的FA1位点高亲和力结合，置换NDQC，猝灭其荧光，实现“关闭”效应，用于血红素检测。实验显示，0–4 μM血红素浓度与荧光强度呈线性关系，表明NDQC-HSA能测定血红素含量。与吲哚美辛相比，血红素对NDQC-HSA荧光影响更大，说明其结合能力强，使NDQC-HSA在生物和环境体系中具有强大的血红素检测能力。

D.细胞成像

MTT实验显示，NDQC对多种细胞无毒性，具有良好的生物安全性，适用于细胞成像。当NDQC与HSA共同培养时，细胞内会出现明亮的荧光，这表明NDQC能够与细胞内的HSA相互作用，从而实现HSA的可视化。细胞共定位实验进一步揭示，NDQC-HSA能够成功定位于线粒体，而与溶酶体的共定位相对较弱。此外，研究者们发现，利用NDQC-HSA的荧光pH敏感性，可以区分正常细胞和肿瘤细胞，这表明NDQC荧光探针可作为一种便捷的癌症检测工具。在SW1990细胞中进行的实验还表明，NDQC-HSA能够在细胞环境中检测游离血红素的水平。

E.纳米载体用于可视化顺铂递送

a)顺铂递送实验

顺铂的加入仅使NDQC-HSA体系的荧光略有降低，表明该体系可用于荧光追踪。

b)光谱分析

紫外-可见光谱显示，NDQC-HSA-顺铂体系在280 nm和340 nm处的吸收峰变化表明NDQC成功标记在HSA上。

c)质谱验证

MALDI-TOF质谱证实了NDQC和顺铂与HSA的结合，且顺铂成功载入NDQC-HSA体系。

d)药物含量检测

ICP-MS检测显示，1 ppb NDQC-HSA中铂含量为0.953 ppb，表明顺铂与NDQC-HSA结合良好。

3、创新点

A. 开发了新型荧光探针NDQC，能特异性结合HSA，灵敏度和选择性高。

B. NDQC在水中自组装成纳米颗粒，与HSA结合后解聚增强荧光，实现快速检测。

C. 实验和模拟表明NDQC主要结合HSA的FA1位点。

D. NDQC可进入细胞与HSA结合，特异性定位于线粒体。

E. 其荧光pH敏感性可区分正常细胞和肿瘤细胞。

F. NDQC-HSA可用于血红素检测和顺铂递送，为相关研究和应用提供新工具。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2024.108120