一种用于生物样本和活细胞中氰化物分析的化学发光探针

氰离子（CN⁻）剧毒，能抑制细胞呼吸，导致ATP生成受阻，极低浓度下即可中毒。血液中氰化物浓度超20 μM即有毒，WHO建议饮用水中氰化物浓度不超50 μg/L。尽管其毒性大，但因广泛应用于工业且存在于多种植物和水果种子中，开发快速有效的氰化物检测方法意义重大。目前检测方法多样，荧光探针法因其高灵敏度和易用性受关注，但存在依赖外部光源，存在穿透深度有限、光漂白和背景荧光干扰等问题。

朱勍团队开发的化学发光探针LCN-2能灵敏、特异地检测水溶液和食品中的氰离子（CN⁻），检测限294 nM，低于WHO标准（1.9 μM）。其在食品检测中准确性高，还能成像活细胞中的CN⁻，展现出巨大应用潜力，为环境和医学检测提供高效工具。

1、研究方法及结果A.LCN-2的设计与合成

图 1 化学发光探针 LCN-2 的合成过程

研究团队设计了一种基于反应的化学发光探针LCN-2，用于检测氰化物。探针LCN-2的合成过程如图1所示。首先，在碱性条件下，将化合物L-8与噻吩-2-羧酸在50°C下反应生成LCN。随后，通过亚甲蓝作为敏化剂，利用单线态氧催化的环加成反应生成LCN-2。所有中间体和探针的表征均通过核磁共振（NMR）和高分辨率质谱（HRMS）完成。

图 2 LCN-2用于CN⁻检测的原理

如图2所示，化学发光探针LCN-2采用1,2-二氧杂环丁烷作为化学发光核心，2-噻吩甲酰基酯作为反应基团。当加入氰化物时，2-噻吩甲酰基团的消除会形成一个不稳定的高能中间体——[LCN-2]*。这个中间体通过化学引发的电子交换发光（CIEEL）途径分解，产生强烈的发光。

B.LCN-2对氰化物的光谱响应

图 3 探针LCN-2的化学发光特性及其与氰化物（CN⁻）反应特性

研究团队在获得LCN-2后评估了其光物理性质和对CN⁻的反应性。实验表明，在加入CN⁻后，探针在550 nm处的发光强度显著增强（图3a），20分钟内达到峰值，60分钟内逐渐减弱（图3b）。HPLC分析显示，LCN-2与CN⁻反应后逐渐分解（图3c）。此外，研究发现LCN-2对不同浓度CN⁻的响应呈线性关系，检测限为294 nM，灵敏度高于其他荧光探针。并且LCN-2响应迅速，5分钟内信号与噪声比达10，鉴于化学发光如无需外部光源、更高的灵敏度和更低的背景噪声的优势，LCN-2特别适合应用于食品样本检测。

C.探针LCN-2的选择性评估

为了验证探针LCN-2在生理条件下的适用性，该团队评估了其对生物系统中常见的各种分析物的选择性。将LCN-2暴露于一系列生物相关物中，在PBS缓冲液（20 mM，pH 7.4）中，将LCN-2对20 μM CN⁻的发光响应与其他分析物进行了比较。结果显示，只有在CN⁻存在时，LCN-2才表现出显著的化学发光信号，而在暴露于其他生物相关干扰物质时，20分钟内几乎没有发光。这些结果表明LCN-2对CN⁻具有很高的特异性，适合在生物环境中使用。

D.探针LCN-2的光稳定性和pH响应

图 4 化学发光探针LCN-2的光稳定性和pH响应特性

如图4a所示，在长时间紫外光照射后，该探针表现出优异的稳定性，其含量保持在初始值的85%以上。如图4b显示，LCN-2在pH 7到9的范围内表现出强烈的化学发光信号，表明该探针在生理环境中表现最佳。良好的紫外光下的光稳定性和在生理pH范围内的有效性能，使其非常适合用于生物成像和活体内的氰化物检测。

2、探针LCN-2的氰化物检测应用

A.食品样本中的氰化物检测

 该团队用LCN-2检测了苹果种子、杏仁、苹果果肉、木薯和利马豆等食品样本中的CN⁻。将2.5 g样本捣碎后置于50 mL 10 mM NaOH溶液中搅拌过夜，过滤并调pH至7.4后加入5 μM的LCN-2，20分钟内观察到显著的化学发光增强。测得样本中CN⁻浓度为8.2到42.4 μM。通过AgNO₃滴定法验证，苹果种子中CN⁻浓度为26.3 μM，与探针测定值25.9 μM接近，证明了探针的准确性。进一步实验显示，加入不同浓度CN⁻后，回收率为98.1%到99.5%，表明LCN-2可靠且适用于食品样本中氰化物浓度的检测，对食品安全具有重要价值。

B.活细胞中氰化物的检测

图 5 探针LCN-2在HeLa细胞中的化学发光成像和相关实验结果

在进行化学发光成像之前，作者使用MTT实验确定了探针的毒性。经过24小时的处理，当LCN-2浓度低于50 μM时，细胞存活率保持在90%以上，表明LCN-2具有低毒性。此外，使用共聚焦显微镜对细胞进行化学发光成像。HeLa细胞与10 μM LCN-2孵育30分钟后，用0或25 μM CN⁻处理。CN⁻存在时，细胞发出明显光信号（图5a），该信号可被羟钴胺猝灭（图5b），表明CN⁻触发发光。发光强度随时间增加，40分钟达峰值，且随CN⁻浓度升高而增强，比空白组高11倍（图5c）。这表明LCN-2能有效检测活细胞中的CN⁻。

3、创新点

A. 设计并合成了一种新型化学发光探针LCN-2，专门用于检测氰离子（CN⁻）。

B. LCN-2检测限低至294 nM，低于WHO标准1.9 μM，可在极低浓度下检测氰化物。

C. LCN-2仅对CN⁻有显著化学发光响应，对其他常见离子和化合物无明显反应。

D. LCN-2可用于活细胞（如HeLa细胞）中CN⁻的成像，具有良好的生物相容性和成像效果。

E. LCN-2在紫外光下稳定，且在生理pH范围（pH 7-9）内表现良好，适合生物成像和氰化物检测。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jfca.2024.107077