癌症早期预警：单细胞端粒酶活性检测的CRISPR-Cas12a芯片

端粒酶是一种在细胞染色体末端合成端粒重复序列（TTAGGG）的核糖体逆转录酶。在正常细胞中，端粒酶活性较低，导致细胞分裂时端粒逐渐缩短。然而，癌细胞通过过表达端粒酶维持端粒长度，从而实现持续增殖。因此，端粒酶活性的检测在癌症诊断、治疗干预和监测中具有重要意义。传统检测方法主要依赖于基于聚合酶链反应（PCR）的端粒重复扩增协议（TRAP），但该方法存在耗时和假阳性信号的问题，限制了其在偏远地区的应用。因此，开发一种无需PCR的端粒酶检测方法具有重要意义。

近日，南京大学、皖南医学院和南京医科大学的研究团队在《Lab on a Chip》杂志上发表了一项创新性研究成果，提出了一种基于CRISPR-Cas12a的单细胞端粒酶活性检测芯片。该技术通过金属有机框架（MOF）和DNA条形码扩增技术与CRISPR-Cas12a系统相结合，实现了单细胞水平上端粒酶活性的超灵敏检测。

研究结果

团队利用dNA功能化的UiO-66纳米颗粒作为信号转换的关键元件。UiO-66纳米颗粒具有独特的结构和性能，其表面丰富的活性位点能够有效结合大量的DNA条形码。当端粒酶存在时，它会与特定的底物发生作用，进而激活UiO-66纳米颗粒上的DNA激活链。这些激活链随后触发CRISPR-Cas12a系统的反式切割活性，实现信号的初步放大。

图 1 DNA功能化UiO-66的表征

如图1展示了DNA成功修饰到UiO-66纳米颗粒表面的透射电子显微镜（TEM）图像和元素分布图。

图 2 DNA从UiO-66释放过程示意图

同时，研究人员对磁性二氧化硅纳米颗粒（MSNPs）进行了精心制备和修饰。如图2展示了在磷酸盐离子作用下，DNA从UiO-66纳米颗粒表面释放的过程，以及释放后荧光信号的变化。他们将端粒酶结合底物（TSs）连接到MSNPs 表面，形成MSNP-TS 延伸探针。当这些探针与含有激活链和互补序列的UiO-66探针相遇时，会通过互补碱基配对的方式进行杂交。随后，加入磷酸盐促使UiO-66纳米颗粒分解，释放出激活链，激活CRISPR-Cas12a系统，对带有荧光标记的FQ报告基因进行切割，产生可检测的荧光信号，从而实现对端粒酶活性的定量检测。

图 3 单细胞捕获微流控芯片示意图

为了进一步提高检测的灵敏度和准确性，研究团队还设计并制造了一种径向微流控芯片（如图4a）。该芯片能够高效地捕获和分离单个细胞，为单细胞水平的端粒酶活性检测提供了有力支持。芯片的每个微通道都配备了特殊设计的钩状结构（如图4c），这些结构基于单细胞的大小、形状和物理特性进行了优化，能够在细胞悬浮液流过时，利用惯性力和细胞间的相互作用，精准地捕获单个细胞，同时有效分离细胞Doublets 或Clusters。研究人员使用A549细胞进行实验验证，通过钙叶黄素染料对细胞进行染色，在显微镜下清晰地观察到单个活细胞被成功捕获（如图4e），证明了该芯片在捕获单个活细胞方面的卓越性能。

在完成单细胞捕获后，研究团队对细胞裂解条件进行了优化，以确保能够高效地提取端粒酶。通过对不同裂解时间的A549细胞进行观察（如图4f），发现细胞在裂解初期细胞膜出现明显变化，30分钟内细胞完全裂解，这为端粒酶的成功提取提供了有力保障。后续的检测结果（如图4g）显示，恶性肿瘤单细胞组与阴性对照组之间的荧光强度存在显著差异，充分证明了该微流控芯片与MOF-DNA生物条形码扩增的CRISPR-Cas12a技术相结合，能够准确地检测单细胞水平的端粒酶活性。

图 4 端粒酶活性的定量分析结果

研究数据充分展示了该检测平台的优势。在对不同数量的A549细胞和B16细胞进行端粒酶活性检测时（如图3b、c），发现荧光信号随着细胞数量的增加而增强，且在10-1000个细胞的范围内呈现良好的线性关系，检测限能够达到单细胞水平。在特异性检测实验中（如图3d），恶性肿瘤细胞组（4T1、A549和B16细胞）的荧光强度明显高于正常细胞组（MCF-10A细胞）和加热阴性对照组，表明该平台能够有效区分肿瘤细胞和正常细胞的端粒酶活性。此外，与传统的TRAP检测方法相比，该平台不仅检测灵敏度更高，而且整个检测过程能够在3小时内完成，大大提高了检测效率。

这项研究成果为单细胞水平端粒酶活性的检测提供了一种创新的方法，展示了该平台在癌症诊断领域的巨大潜力。其高灵敏度、高特异性和快速检测的特点，有望在临床实践中广泛应用，为早期癌症的诊断和治疗提供重要的技术支持，推动癌症诊断技术迈向新的台阶。

原文链接：https://doi.org/10.1039/d4lc00619d