1.引言

CRISPR-Cas12a介导的检测与传统PCR相比，提供了一种快速且无扩增的核酸检测策略。因此，开发一种新型的高可靠性、低成本、操作简单的CRISPR-Cas12a介导的双模生物传感系统备受关注。基于上转换纳米颗粒（UCNPs）的发光共振能量转移（LRET）生物传感系统已被用于核酸检测，与天然酶相比，纳米酶比色生物传感器的灵敏度受到其较低的催化活性的限制。核心-卫星纳米结构很有希望解决这个问题，因为它们在单个离散纳米结构中有大量耦合的纳米粒子对，以提高灵敏度。因此，需要在一个混合纳米平台上，将基于UCNP的LRET模式和基于纳米酶的比色模式相结合，建立一种新的CRISPR-Cas12a介导的双模式生物传感系统，实现核酸快速、可靠、灵敏的检测。

本研究报道了一种基于CRISPR-Cas12a介导的双模式生物传感平台，用于核酸检测。该平台结合了上转换发光共振能量转移(LRET)模式和基于功能化UNSC-ssDNA@MGO纳米复合材料的纳米酶比色法模式。该生物传感纳米平台通过ssDNA和MGO之间的pi-pi叠加，将非特异性ssDNA共轭的上转换纳米酶(UCNP@SiO₂@CeO₂-ssDNA，表示为UNSC-ssDNA)吸附在Fe₃O₄复合MGO纳米片上形成的，其中UCNPs作为上转换发光(UCL)供体，氧化铈(CeO₂)作为纳米酶，MGO同时作为发光猝灭剂和磁分离器。在上转换发光模式（暗）和比色模式（透明）下，生物传感纳米平台最初处于“OFF”状态，因为UCNPs的发光由于紧密附着而被MGO淬灭，并且磁性去除UNSCs后测试溶液中没有纳米酶。在靶核酸存在的情况下，UNSCs上的ssDNA被活化的Cas12a切割，UNSCs从MGO表面分离。在3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)检测中，纳米酶在溶液中发光恢复并释放，从而诱导颜色变化。该双模式生物传感平台显示出快速灵敏的核酸检测。该平台通过整合LRET和纳米酶比色法，实现了核酸的双重信号输出，提高了检测的可靠性和灵敏度。

图1.寡核苷酸标记UCNP@SiO₂/CeO₂纳米复合材料的构建及其在基于crispr-cas12的双模生物传感平台中的应用示意图(A)构建了以UCNPs为核心，超小CeO₂纳米点锚定在UCNP@SiO₂外壳上的核心-卫星UNSC纳米复合材料。(B)上转换发光试验。(C)比色试验。

2.结果与讨论

UCNPs@SiO2/CeO₂杂化纳米复合材料的合成与表征

为构建生物传感纳米平台，首先合成了NaYF4:Yb/ErUCNPs和NaYF4:Yb/Er@ NaYF4UCNPs，尺寸分别为29.3±2.3nm和52.9±6.6nm。然后采用溶胶-凝胶法制备反胶束微乳液，将合成的核壳型UCNPs包覆在SiO₂外壳上，再用APTES修饰使其胺基功能化，得到80.4±4.4nm的单分散UCNP@SiO₂-NH2。同时，合成了尺寸为5.2±1.1nm的超小型CeO₂纳米晶体，通过配体交换法用BMPA修饰，得到BMPA-CeO₂，分散在无水DMF中。BMPA-CeO₂通过亲核取代反应固定在UCNP@SiO₂-NH2表面，通过优化UCNP@SiO₂与CeO₂的质量比，合成90.8±3.5nm的UCNP@SiO₂/CeO₂纳米复合材料，CeO₂纳米晶体均匀分布在二氧化硅表面。元素映射、DLS、XPS和XRD证实了材料的组成和结构。UNSC的UCL光谱在546nm和660nm处显示出两个发射峰，ssDNA修饰后，在紫外可见光谱中鉴定出260nm处的DNA特征峰。合成的UCNP@SiO₂/CeO₂-ssDNA纳米复合材料的表面电位为-41.7±0.6mV。此外，采用PEI改性法制备了MGO纳米片，平均尺寸约为450nm。

图2.UCNP@SiO₂/CeO₂杂化物的合成与表征。

CRISPR-Cas12a对ssdna功能化UNSC的反式切割效应用于上转换发光分析

该研究利用SARS-CoV-2的S-cDNA作为靶DNA，设计了相应的CRISPRRNA(crRNAs)。实验证实，S-cDNA的存在可以激活CRISPR-Cas12a系统的反式切割活性。将CRISPR-Cas12a系统整合到生物传感平台后，在546nm和660nm处观察到上转换发光强度显著增加，这归因于激活Cas12a的反式切割效应。

为提高猝灭效率，研究确定MGO的最佳浓度为0.4mg/mL，此时猝灭效率高达95%。通过分析目标cDNA不同浓度下的UCL光谱评估生物传感平台的性能，结果表明，在546nm和660nm处，UCL强度随着S-cDNA浓度的增加而显著增强。S-cDNA检测的LOD分别为320fM和390fM。Orf-cDNA检测方法的LOD分别为380fM和430fM，表明该上转换荧光检测方法可用于生物样品中cDNA的精确定量。

图3.基于Crispr-cas12的UCL检测性能评价。

UNSC过氧化物酶模拟活性评价及比色分析

该研究通过传统的基于TMB的比色分析，研究了模拟过氧化物酶的UNSC纳米杂交体的催化活性。结果表明，UNSC纳米酶能够促进H₂O₂的分解，将无色的TMB氧化为蓝色的氧化TMB(oxTMB)，在652nm处显示出特征吸光度峰。UNSC纳米酶的Vmax和Km值分别为2.929×10⁻⁸Ms⁻¹和19.39×10⁻³M，表明其具有良好的模拟过氧化物酶的催化活性.优化结果表明，UNSC模拟过氧化物酶活性的反应条件在pH4.0和37℃条件下相对活性最大。

通过利用MGO的磁性来分离DNA裂解的UNSC，评估了该生物传感器的比色模式的性能。结果表明，随着S-cDNA浓度增加，溶液颜色从浅蓝色逐渐加深，且652nm处的吸光度强度与S-cDNA的对数浓度呈线性相关，检测限为28.4pM。Orf-cDNA检测的LOD为33.1pM，证明了该比色检测模式对cDNA精确定量的可靠性。

图4.UNSCs过氧化物酶模拟催化活性评价及其在生物传感平台上的应用。

双模生物传感平台性能分析

为了评估双模式生物传感平台检测SARS-CoV-2基因的特异性，该研究以五种不同类型的病毒核酸(SARS-CoV-1、HIV-1、HIV-2、HBV和InfA)以及扰变DNA(Scr-S和Scr-Orf)作为阴性样本进行了分析。凝胶电泳结果表明，只有S-cDNA的存在会导致ssDNA1条带消失，表明阴性病毒cDNA样本无法激活CRISPR-Cas12a系统启动反式切割。

生物传感平台进一步证实了S-cDNA检测的特异性，5种病毒cDNA以及1nM浓度下的Scr-S和2MM-S都不能恢复上转换发光，这与凝胶电泳结果一致。比色模式下，也只有1MM-S和S-cDNA基团存在时，反应溶液的颜色和652nm处的吸光度强度才显著增加。评估结果表明，该基于CRISPR-Cas12a的双模生物传感平台对靶DNA检测具有高特异性，对非靶DNA无反应，可能成为特异性检测SARS-CoV-2基因的工具.

图5.双模生物传感平台检测S-cDNA的选择性研究。

为了测试生物传感器的可靠性和稳定性，该研究检测了小鼠血浆和cfBALF中的目标DNA。结果表明，用于检测BALF或血浆中S-cDNA的上转换发光强度和652nm处的吸光度没有显著差异，表明该双模式生物传感平台在复杂基质中保持功能的稳健性。不同基质条件下加标样品的荧光法回收率为94.0~107.0%，比色法回收率为85.7~103.7%，%RSD值在10%以下，表明该生物传感平台具有良好的精度和重复性。

该研究表明，该CRISPR-Cas12a介导的双模式生物传感平台具有出色的特异性、稳定性、准确性和可重复性，有望实现复杂基质中核酸的敏感和准确检测。与FAM-ssDNA-BHQ1报告器相比，基于上转换发光模式的UNSC平台的LOD提高了43倍，且该平台还提供了一种替代的视觉评估方法。

图6.双模生物传感平台稳定性及基质干扰分析。

3.总结

本研究设计了一种CRISPR-Cas12a介导的双模式核酸检测生物传感平台，结合了上转换发光共振能量转移(LRET)模式和基于功能化UNSC-ssDNA@MGO纳米复合材料的纳米酶比色法模式。该平台利用ssDNA和MGO之间的π-π堆叠，将上转换纳米酶(UNSC-ssDNA)吸附在Fe₃O₄复合MGO纳米片上，其中UCNPs为LRET供体，CeO₂为纳米酶，MGO兼具猝灭和分离功能.在无靶核酸时，平台处于“OFF”状态，UCNPs发光被MGO猝灭，磁性分离后无纳米酶。存在靶核酸时，Cas12a激活并切割UNSC-ssDNA上的ssDNA，释放UNSC并恢复发光，同时CeO₂纳米酶催化TMB反应产生颜色变化。该平台实现了快速灵敏的核酸检测，上转换发光和比色模式的检测限(LOD)分别为320fM和28.4pM24.检测时间约为1.5小时，且在不同生理条件和pH值下信号稳定。该双模式平台提高了核酸相关疾病诊断的可靠性和灵活性。CRISPR-Cas12a系统具有高特异性和灵敏度，在即时检测方面展示出优势。该生物传感平台只需重新设计CRISPRRNA序列即可轻松适应其他基于核酸的检测。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116963