MALDI-TOF质谱在分枝杆菌鉴定中的应用：提取方法的优化与效果分析 结核杆菌感染现状：严峻的全球健康挑战

结核杆菌引发的疾病在全球范围内持续肆虐，肺结核作为其主要表现形式，每年的新发病例数和死亡人数令人触目惊心。据世界卫生组织统计，2022年全球约有1060万结核病病例，约130万人因此失去生命。与此同时，非结核分枝杆菌感染也呈上升趋势，如Mycobacterium avium等菌种引发的疾病，不仅治疗难度大，还面临着严重的抗生素耐药问题，给全球医疗界带来了巨大的压力。

MALDI-TOF MS 技术原理与结核杆菌鉴定困境

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术是微生物鉴定领域的重要手段。其工作原理是将微生物样本的质谱与数据库中的参考谱图进行比对，通过分析蛋白质谱图来确定微生物的种类。在实际操作中，细菌样本与基质溶液混合干燥后，经激光照射使基质吸收能量并促使样本离子化，随后根据离子的质荷比进行分离和鉴定。然而，结核杆菌细胞壁富含脂质，尤其是分枝菌酸，这使得蛋白质提取极为困难，严重阻碍了MALDI-TOF MS技术在结核杆菌鉴定中的有效应用。

蛋白质提取方案设计与实验过程

波兰科学院的研究团队针对结核杆菌蛋白质提取难题，精心设计了四种不同的方案并展开实验。方案一遵循制造商的标准建议，对液体培养物进行离心、灭活、乙醇处理等一系列操作；方案二在标准提取的基础上增加了珠磨细胞破碎步骤，借助氧化锆珠的机械作用破坏细胞壁；方案三在灭活步骤添加Tween 80，试图改善细胞处理效果；方案四则采用氯仿-甲醇额外提取步骤，先去除细胞部分脂质后再进行后续处理。研究选用了Mycobacterium bovis BCG的四个菌株以及Mycobacterium peregrinum、Mycobacterium smegmatis和Mycobacterium farcinogenes三个菌株，分别在不同培养条件下进行培养和实验。

实验结果分析：方案四优势显著

提取效果比较：根据不同方案提取的蛋白质进行MALDI-TOF MS分析，方案4的得分明显高于其他方案，表明其在提取效果上的优越性。

在方案4下，M. bovis BCG PCM 2098的得分值达到2.055，显示出高识别准确性。

表1 M. bovis BCG PCM 2098的MALDI-TOF MS生物分型鉴定

结果显示，使用氯仿-甲醇提取的样品在质谱分析中产生了更高强度的主要峰。

图1 采用不同方案提取的牛分枝杆菌卡介苗PCM 2098（A - D）和耻垢分枝杆菌PCM 907（E - H）的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）图谱：A、E）方案1（标准提取程序）；B、F）方案2（珠磨法）；C、G）方案3（添加Tween80）；D、H）方案4（氯仿-甲醇法）。

质谱分析结果：通过分析不同提取方案下获得的质谱图，发现方案4的蛋白质谱图具有更清晰的特征峰，且主要峰的强度更高，显示出该方案在分枝杆菌的鉴定中具有重要的应用价值。

图2 使用方案4（氯仿-甲醇额外提取步骤）获得的分枝杆菌属物种的基质辅助激光解吸/电离飞行时间蛋白质质谱图。A) M. bovis BCG PCM 2097; B) BCG PCM 2098; C) M. bovis BCG Moreau; D) M. bovis BCG Pasteur; E) M. farcinogenes PCM 2220; F) M. peregrinum PCM 639; G) M. smegmatis PCM 907.

 统计学分析：从表3中可以看出，经过Dunn（1964）Kruskal-Wallis多重比较及Holm方法调整p值后，在各方案比较中，bead-beating-Chloroform-methanol、Bruker-Chloroform-methanol、Tween80-Chloroform-methanol这三组比较的p值均小于0.05（以粗体显示），表明这些组间存在显著差异。这意味着方案4（Chloroform-methanol）与其他方案（bead-beating、Bruker、Tween 80）在MALDI-TOF分析所得的log score值上有显著不同，其效果明显优于其他方案，从而确定了方案4在结核杆菌蛋白质提取及后续MALDI-TOF鉴定中是最有效的方法，为临床微生物学实验室选择合适的蛋白质提取方案提供了有力的数据支持和统计学依据。

表2 Dunn (1964) Kruskal-Wallis多重比较；p值采用Holm方法进行调整。各行包含各方案比较的结果，具有统计学显著性的结果以粗体突出显示。

图3的结果显示M. bovis BCG菌株（如BCG Moreau、BCG Pasteur等）形成一个明显的聚类分支，表明其内部菌株在质谱图谱特征上具有较高相似性。M. tuberculosis菌株形成另一个聚类分支，且两个分支虽有明显区分，但整体呈现一定的相似性，位置相对接近，这体现了M. bovis BCG与M. tuberculosis密切的亲缘关系和相似的遗传结构，为其在进化和分子层面的联系提供了质谱分析的证据。进一步验证了MALDI-TOF MS 技术在区分这两类菌株时的有效性，尽管它们相似，但仍能在数据库中呈现出可区分的聚类特征，有助于在实际鉴定工作中准确识别这两种重要的分枝杆菌。

图3 展示了由Biotyper 3.1软件生成的布鲁克MALDI-TOF数据库中牛分枝杆菌卡介苗（M. bovis BCG）物种（蓝色）和结核分枝杆菌（M. tuberculosis）集群（红色）的主光谱图（MSP）聚类树状图。

方案四优势成因与脂质分析

方案四的成功得益于其对结核杆菌细胞壁脂质的有效处理。氯仿-甲醇混合物能够去除细胞表面的脂质，使得核糖体蛋白等关键蛋白质更容易被提取出来，从而为MALDI-TOF MS 分析提供了更优质的样本。此外，该方案还具有独特的优势，即能够从同一样本中同时分析蛋白质和脂质。研究团队运用薄层色谱（TLC）和MALDI-TOF MS技术对脂质进行分析，发现氯仿-甲醇提取物中的磷脂和极性脂质与总脂质中的成分具有高度一致性，这为结核杆菌的鉴定提供了新的视角和依据。

图4 展示了慢生长和快生长分枝杆菌属物种的总脂质以及氯仿-甲醇提取物的薄层色谱（TLC）脂质图谱。其中，1、3、6、8分别代表M. farcinogenes PCM 2220、M. smegmatis PCM 907、M. bovis BCG Pasteur、M. bovis BCG PCM 2098的总脂质（250 μg）；2、4、7、9分别代表上述对应菌株的氯仿-甲醇提取物（250μg），5为磷脂酰乙醇胺（PE）标准品（10μg）。TLC采用氯仿-甲醇-水（65:25:4，v/v/v）的溶剂系统展开。在检测磷脂时（A），使用了Dittmer和Lester试剂，磷脂化合物的Rf值分别为：Ph1为0.45；Ph2为0.50；Ph3为0.54；Ph4为0.61；Ph5为0.66。在检测其他脂质时（B），应用了硫酸铜试剂，脂质化合物的Rf值分别为：L1为0.20；L2为0.28；L3为0.33；L4为0.43；L5为0.52；L6为0.57；L7为0.61；L8为0.77；L9为0.80；L10为0.83。通过这些图谱和数据，可以对不同菌株的脂质成分进行比较和分析，有助于深入了解分枝杆菌的脂质特性及其在不同提取条件下的差异。

 研究的局限性与未来展望

尽管本研究取得了重要成果，但也存在一定的局限性。研究仅涉及了结核杆菌复合群中的部分物种，对于慢生长NTM物种的代表性不足。然而，不可否认的是，这一研究为临床微生物学实验室的结核杆菌鉴定带来了新的希望。未来，进一步优化蛋白质提取方法、扩大研究物种范围以及完善脂质数据库等工作，将有望推动MALDI-TOF MS技术在结核杆菌诊断领域的进一步发展，为全球结核病防控提供更有力的支持。

参考文献：

Machnik K, Smoliński J, Paściak M. Evaluation of protein extraction protocols for MALDI-TOF Biotyper analysis of mycobacteria[J]. Journal of Microbiological Methods, 2024, 227: 107052.