支持深度学习的开放式单细胞拉曼光谱，用于真实环境中快速识别空气传播的病原体

空气传播病原体是院内感染和呼吸道疾病暴发的重要媒介，每年导致全球超770万人死亡。传统检测方法如培养法耗时数日，且无法检测进入"存活但不可培养"（VBNC）状态的细菌；分子检测（PCR、ELISA等）依赖预设识别元件，难以覆盖复杂环境中的多样性微生物；宏基因组测序虽无偏但需大量生物量且耗时数周。现有技术在实时性、灵敏度和适用性方面存在显著局限。本研究提出Raman-OSDL系统，首次将开放集深度学习（OSDL）与单细胞拉曼光谱结合，突破传统封闭集模型在真实环境中的误判瓶颈。通过自主研发的微生物气溶胶生成收集装置（MAGC），建立首个空气源病原菌拉曼光谱数据库，模拟真实气溶胶状态下的细菌特征。创新性地引入双阈值开放集策略（Softmax/Openmax阈值）优化注意力神经网络（aNN）模型，实现了：

1.高精度识别：对5种目标病原菌（肺炎克雷伯菌等）识别准确率达93%；

2.未知菌排除：对未训练空气细菌的识别准确率84%，假阳性率较传统封闭模型降低36%；

3.超高灵敏度：检测限达1:1000（病原菌/背景菌比例）；

4.混合检测能力：可同时识别单一致病菌或多病原共存场景。

在含4600余种细菌的真实空气样本验证中，系统1小时内完成气溶胶采集（30分钟）、单细胞拉曼检测（25分钟）及OSDL分析（5分钟），准确检出丰度低至0.1%的病原菌（如铜绿假单胞菌）。与宏基因组测序和培养法交叉验证显示，其对高/低丰度病原体的检测结果高度一致，且无需预培养步骤。研究团队进一步构建了包含20种常见病原菌的开放数据库，支持模型持续扩展。该技术为遏制空气传播疾病提供了革命性工具，特别是在院内感染防控、突发性疫情溯源和公共环境生物安全监测领域具有重要应用价值，标志着拉曼病原检测从实验室走向真实复杂环境的里程碑突破。

图一：RAPD 工作流程概述

研究团队开发了快速空气病原体检测（RAPD）平台，如图一所示通过单细胞拉曼光谱精准识别空气传播病原体。该平台由三部分组成：1）多功能气溶胶生成收集（MAGC）装置，可模拟真实空气环境生成含特定病原体的气溶胶，以 50 升 / 分钟流速在 20 分钟内采集 1000 升空气样本，通过凝胶膜过滤捕获细菌（凝胶溶于水且不影响拉曼信号）；2）预处理与拉曼采集系统，对气溶胶样本进行水洗、风干等处理；3）深度学习模型用于数据分析。研究选取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等五种高致病性空气传播病原体，结合非致病性空气细菌及环境样本，构建包含 7552 个单细胞拉曼光谱的数据库（6149 个病原体，1403 个非目标菌）。实验发现，同种细菌在液体培养与空气悬浮状态下的拉曼光谱存在显著差异：主成分分析显示空气样本与液体样本聚类分离（Bray-Curtis 距离，P<0.01），1322 和 1578 cm⁻¹ 峰强度在空气环境中普遍降低（除铜绿假单胞菌外，P<0.05），表明气溶胶状态显著改变细菌生理特征。该平台突破传统实验室液体培养的局限性，首次实现基于真实空气环境细菌生理状态的拉曼建模，为精准识别复杂空气微生物提供了关键技术支撑，解决了空气病原体检测中环境适应性差异导致的光谱偏移难题。

这种基于拉曼光谱的开集深度学习算法（Raman-OSDL）可用于真实空气环境中病原体的精准识别与未知细菌类别的检测。传统闭集算法（如 LDA、RF、SVM、aNN）在已知病原体上表现优异（aNN 准确率 97%），但面对训练集未涵盖的未知空气细菌时误判率高达 100%。即便引入 "其他" 类作为负样本，未知样本仍有 52% 被误判为病原体。为此，研究提出两种开集策略：1）在 softmax 函数中设定概率阈值（0.98），使未知类别识别率提升至 83%，但病原体准确率下降至 92%；2）采用 openmax 函数结合 Weibull 分布重构激活向量，通过二次训练和阈值优化（0.996），成功将五类病原体平均识别率维持在 93%，同时将未知样本识别准确率提高至 84%。针对特定病原体（如大肠杆菌）与高相似度未知细菌的误判问题，进一步调整阈值后，模型对大肠杆菌的识别准确率达 93%，未知样本准确率提升至 100%，误判率降为零。该方法突破了传统闭集算法在真实空气微生物检测中的局限性，首次实现了对目标病原体的可靠识别与未知细菌类别的有效区分，为复杂环境下的生物气溶胶监测提供了创新解决方案。

图二：在真实世界空气样本中鉴定单个或多个病原体。在受 （A） 单个肠道链球菌和 （B） 五种病原体（即贝伊不动杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和肠道葡萄球菌）污染的真实空气样品中鉴定的病原体的相对丰度（C 和 D） 在两个被肠道链球菌 （c） 和五种病原体 （d） 污染的空气样品中拉曼-OSdl、传统培养和宏基因组学方法的鉴定结果比较（E） 铝上一个预测的金黄色葡萄球菌细胞（由红色圆圈勾勒）的显微图像，以及其拉曼光谱与训练中使用的真实金黄色葡萄球菌的拉曼光谱的比较（F） （e） 中预定和真实金黄色葡萄球菌之间拉曼光谱的线性回归分析。（G） Raman-OSdl、Raman-close set dl 和两种用于真实世界病原体鉴定的传统方法之间的性能比较。（H） 使用 Raman-OSdl 和传统栽培方法对另外六种真实世界空气环境的识别结果。

如图二所示该研究验证了 Raman-OSDL 方法在真实空气环境中的病原体检测能力。通过向含 > 4600 种本土微生物的真实空气样本中人为添加单种（肠炎沙门氏菌）或混合病原体（含金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等五种），采集 2111 个单细胞拉曼光谱并输入预训练模型。模型基于交叉验证确定的真阳性阈值（各病原体假阳性率均值 + 3SD）和 1% 相对丰度截断值进行判读：肠炎沙门氏菌在单病原样本中占主导，金黄色葡萄球菌虽未培养出菌落，但拉曼光谱相关系数达 0.94（P<0.001），且宏基因组测序检测到其 < 1% 丰度，推测可能处于 VBNC 状态或低丰度。五病原混合样本中，金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌被三种方法（拉曼、培养、测序）共同检出，大肠杆菌仅拉曼法报告阳性（丰度> 1%）。进一步对餐饮、商场等六类环境空气样本测试显示，拉曼法与培养法阳性结果完全一致，且能额外检出培养法遗漏的病原体。整个检测流程（采样 - 预处理 - 测量 - 分析）仅需 1 小时，较传统培养（>12 小时）和测序（数天）效率显著提升。

原文doi： https:// doi.org/10.57760/sciencedb.12074